大鼠不同胚層來源成骨細胞生物學行為比較研究

陳玉玲 許雄程 江俊 陽雪 吳玉銘 何夢嬌 駱凱

報道顯示，頜骨與長骨等不同胚層來源的骨組織存在位點特異性差異[1-2]。某些骨組織疾病如雙膦酸鹽骨壞死[3]、家族性巨頜癥[4]和副甲狀腺功能亢進頜骨腫瘤綜合征[5]等僅見報道于頜骨。血管生成在骨改建過程中發揮著重要的作用，與骨組織的病理性改變如Paget病、骨質疏松癥等密切相關[6-7]。成骨細胞(osteoblasts, OBs)由間充質干細胞分化而來，不僅參與骨組織的形成和礦化，還可參與骨組織血管化的調控[8-9]。當前，有關不同胚層來源OBs間促成血管能力的差異還不明確。本研究擬通過培養大鼠下頜骨成骨細胞(mandibular osteoblasts, MOBs)與股骨成骨細胞(femoral osteoblasts, FOBs)，探討不同胚層來源OBs在成骨與成血管相關細胞因子表達方面的差異，為探討位點特異性骨疾病的發病機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，體重(100±20) g(南京軍區福州總醫院比較醫學科提供)。實驗嚴格遵守福建醫科大學動物倫理委員會準則。

1.2 實驗試劑及儀器

DMEM低糖培養液、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)(Hyclone，美國)；膠原酶、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松、茜素紅S(Sigma，美國)；青霉素、鏈霉素、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、MTT、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；TRIzol?Reagent(Life Technologies，美國)；熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM、反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)；大鼠血管生成素-1、成纖維生長因子-2 ELISA試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司)；細胞培養箱、 冷凍高速離心機(Heraeus，德國)；超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)； 倒置熒光相差顯微鏡(Olympus，日本)；iMARK酶標儀(Bio-Rad，美國)；實時熒光定量PCR儀(Roche LightCycler 480，德國)。

1.3 方法

1.3.1 成骨細胞分離培養 大鼠經腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)麻醉處死，參照文獻[10]方法，分離股骨和下頜骨，去除骨膜、骨髓、松質骨、肌肉等組織，皮質骨經PBS清洗后剪成約1～2 mm骨塊。37 ℃ 0.25%胰蛋白酶消化10 min，DMEM培養液蕩洗，0.1%膠原酶繼續消化30 min，棄上清。繼續消化1 h，收集上清。1 500 g離心后棄上清，加入含10% FBS、 100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM低糖培養液重懸后接種于培養瓶，置培養箱內培養。每3 天更換培養液。待細胞生長達90%融合時進行消化傳代。選擇3 代以內細胞進行實驗。

1.3.2 MTT檢測 以5×103個/孔的密度將MOBs與FOBs分別接種于96 孔板內，接種第3、 7 天采用MTT比色法對細胞的增殖能力進行檢測。每個時間點取2 組細胞各6 孔，每孔加入200 μl新鮮配制的MTT(5 g/L)，37 ℃孵育4 h后小心吸棄各孔內培養液，加入200 μl的二甲基亞砜，低速震蕩10 min，酶標儀檢測各孔492 nm處吸光度值(A)。

1.3.3 ALP染色 以2×104個/孔的密度將MOBs與FOBs分別接種于24 孔板內， 1 d后更換成骨誘導液(含50 mg/ml 抗壞血酸、 2 mmol/L β-甘油磷酸鈉和10 nmol/L地塞米松的DMEM)[10]。成骨誘導7 d后用采用95%乙醇固定15 min，進行ALP染色。

1.3.4 ALP活性檢測 以2×104個/孔的密度將MOBs與FOBs分別接種于24 孔板內，于成骨誘導后第3、 7 天棄培養液，PBS漂洗3 次，每孔加入200 μl RIPA裂解液裂解細胞，取50 μl的細胞裂解液，參照ALP檢測試劑盒操作，酶標儀檢測各孔405 nm處A值。取同一孔細胞裂解上清液，參照細胞總蛋白試劑盒說明書測定總蛋白濃度。ALP結果用細胞總蛋白進行標準化。

1.3.5 礦化結節檢測 以2×104個/孔的密度將MOBs與FOBs分別接種于24 孔板內，連續成骨誘導培養14 d后棄培養液， 95%乙醇室溫固定15 min。1%茜素紅染液染色10 min，蒸餾水洗 3 次。 10 mmol/L磷酸鈉溶解的10%氯化十六烷基氨基吡啶室溫下洗脫10 min，酶標儀測570 nm處A值。

1.3.6 熒光定量PCR檢測 以1×105/孔的密度將大鼠MOBs與FOBs接種于6 孔板內，經成骨誘導7 d后棄培養液，PBS 洗3 次，經Trizol提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。實時熒光定量PCR檢測各組細胞ALP、RUNX2、I型膠原(collagen type I alpha 1, Col-Iα1)、骨鈣素(Osteocalcin,OC)、血管生成素1(angiopoiettin-1, Angpt-1)和成纖維生長因子2(Fibroblast growth factor, FGF-2)的表達，以GAPDH為內參。GAPDH上游引物為：CGGCAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG，下游引物為：ACGACATACTCAGCACCAGCATCACC；ALP上游引物為:CCTAGACACAAGCACTCCCACTA，下游引物為：GTCAGTCAGGTTGTTCCGATTC；RUNX2上游引物為：TCTGACTGGAAGAGCGGAGAG，下游引物為：GAGTGGGGAACACACAGGTCT；Col-Iα1上游引物為：TCTGACTGGAAGAGCGGAGAG，下游引物為：GAGTGGGGAACACACAGGTCT；OC上游引物為：TCCCAGTATGAGAGTAGGTGTCC，下游引物為：GGCTCAGATAAGAGGGGTAAGAC；Angpt-1上游引物為TATGGATGTGAATGAAGGAGGATGG，下游引物為ACTGCCTCTGACTGGTTATTGC；FGF-2上游引物為CTGGCTATGAAGGAAGATGGAC，下游引物為CGGTAAGTGTTGTAGTTATTGGAC。

1.3.7 ELISA檢測 以1×105/孔的密度將大鼠MOBs與FOBs分別接種于6 孔板內，經成骨誘導培養7 d后，收集培養液上清。參照ELISA試劑盒說明書，檢測培養液上清中Angpt-1和FGF-2的含量。

1.4 統計分析

2 結 果

2.1 成骨細胞原代培養及形態觀察

大鼠頜骨及股骨消化液接種至培養瓶， 1 d后即可觀察到個別散在成骨細胞貼附于培養瓶底。 3 d后，細胞逐漸增加，呈梭形、紡錘形、三角形和多邊形(圖1A～1B)。7 d后，細胞匯合成層(圖1C～1D)。 倒置顯微鏡下MOBs與FOBs形態未見顯著差異。12～15d左右，細胞達90%融合，進行傳代。

圖1 MOBs與FOBs原代培養 (×100)

Fig 1 Primary culture of osteoblasts from mandible and femur (×100)

2.2 細胞增殖能力比較

MTT比色法檢測結果顯示，細胞接種后3 d， MOBs的A值略高于FOBs，但差異無統計學意義；接種后7 d， MOBs的A值顯著高于FOBs(P<0.05)(圖2)。該結果提示MOBs的增殖能力優于FOBs。

2.3 ALP染色及活性比較

成骨誘導7 d MOBs與FOBs的ALP染色均可著色， FOBs著色更深(圖3)。成骨誘導3、 7 d FOBs的ALP活性均顯著高于MOBs(圖3)，與染色結果一致。

圖2 MOBs與FOBs增殖能力比較

圖3 MOBs與FOBs ALP表達比較 (×40)

Fig 3 ALP activity comparison between MOBs and FOBs (×40)

2.4 礦化結節形成能力比較

成骨誘導14 d， 肉眼可見MOBs與FOBs均形成礦化結節。倒置相差顯微鏡下觀察，FOBs所形成的礦化結節數量較多(圖4)。定量分析結果顯示MOBs礦化結節量顯著少于FOBs(圖4)。結果提示FOBs形成礦化結節的能力強于MOBs。

2.5 成骨相關基因表達比較

實時熒光定量PCR結果顯示，成骨誘導7 d， FOBs成骨相關基因ALP、RUNX2、Col-Iα1和OC的表達均顯著高于MOBs(P<0.05)(圖5)。

2.6 成血管相關基因表達比較

實時熒光定量PCR結果顯示，成骨誘導7 d， MOBs成血管相關基因Angpt-1和FGF-2的表達顯著高于FOBs(P<0.01)(圖6)。

2.7 成血管相關細胞因子表達比較

ELISA檢測結果顯示，成骨誘導7 d，MOBs上清液中成血管相關細胞因子Angpt-1和FGF-2的表達均顯著高于FOBs(P<0.01)(圖7)，提示MOBs可產生更高水平的促成血管因子參與血管生成調控。

圖4 MOBs與FOBs礦化結節形成能力比較 (×40)

Fig 4 The comparison of mineralized nodule formation between MOBs and FOBs (×40)

圖5 MOBs與FOBs成骨相關基因表達

圖6 MOBs與FOBs成血管相關基因表達 圖7 MOBs與FOBs成血管相關細胞因子表達

Fig 6 Angiogenesis-related gene expression of MOBs and FOBs Fig 7 Angiogenesis-related cytokine expression of MOBs and FOBs

3 討 論

當前，學者們對來源于外胚層的頜骨及來源于中胚層的長骨細胞的比較研究主要集中在骨髓基質細胞，頜骨骨髓基質細胞的增殖能力、體內外成骨、成血管及其對自噬與凋亡的耐受均優于長骨來源的骨髓基質細胞[11-14]。OBs作為骨組織的主要細胞，在骨組織形成及改建過程中發揮重要的作用。現有的針對不同胚層來源OBs間生物學行為差異的研究報道較少，且研究結果不一[15-16]。Lee等[15]人通過基因芯片檢測了不同胚層來源的人頜骨與髂骨OBs成骨相關基因的表達情況，結果發現頜骨來源的OBs具有增殖能力強、成骨分化能力低的特點。Reichert等[16]則通過體外培養不同年齡山羊頜骨與脛骨的OBs，發現年輕山羊的MOBs增殖能力較低，而成骨分化能力較高。

本實驗通過體外培養大鼠MOBs與FOBs，探討不同胚層來源OBs的生物學行為差異。研究結果顯示MOBs與FOBs相比，細胞的增殖能力更高，但反應細胞成骨分化能力的指標如ALP的表達、體外礦化結節形成能力以及成骨相關基因ALP、RUNX2、Col-Iα1和OC的表達均較低。該結果提示來源于外胚層的MOBs與來源于中胚層的FOBs相比，細胞的增殖能力更強但成骨分化能力較低。這一結果與Lee等人[15]的研究結論一致，但與Reichert等[16]的研究結果不同，究其原因，可能與不同實驗環境以及研究對象的不同有關。

在骨組織形成過程中，毛細血管的長入在保證骨組織獲得充足的血供與營養方面發揮重要的作用。新近研究發現，OBs可通過旁分泌成血管相關細胞因子(如Angpt-1和FGF-2)調控血管內皮細胞，但具體機制尚未明確[8-9]。Angpt-1可穩定血管內皮細胞，同時促進血管形成過程中血管分支的形成[17]。FGF-2不僅可促進血管內皮細胞的增殖，還可調控血管側支循環的形成[18]。有關不同胚層來源OBs間促成血管能力的比較目前尚未見報道。本實驗首次采用熒光定量PCR及ELISA比較了大鼠不同胚層來源OBs成血管相關細胞因子Angpt-1和FGF-2的表達水平。結果顯示，相比中胚層來源的FOBs，外胚層來源的MOBs表達更高水平的Angpt-1與FGF-2，提示MOBs有可能擁有更強的促成血管能力，該結論尚待進一步研究證實。

本實驗條件下對大鼠不同胚層OBs間生物學行為比較結果發現，中胚層來源的FOBs成骨分化能力較高，而外胚層來源的MOBs則表達較高的成血管相關細胞因子。結合以往研究報道[11-16]，可能與不同胚層來源的骨組織存在位點特異性有關。不同胚層OBs在表達成骨及成血管相關因子方面不同的具體原因，及該特點對不同骨位點OBs與內皮細胞間相互作用影響的機制仍有待進一步探討。對不同胚層來源OBs生物學行為差異調控機制的研究將對闡明骨位點特異性疾病的發病機制及治療有所裨益。