補體C3在2型糖尿病及正常大鼠脂肪干細胞中甲基化差異研究

王蕾 陳旭濤 丁鋒 劉向東 宋應亮

2型糖尿病(T2DM)是一種先天性免疫和低度慢性炎癥性疾病，患者體內(nèi)高脂高糖環(huán)境，高炎癥狀態(tài)等，對牙周治療及種植修復都會產(chǎn)生較大影響[1]。補體系統(tǒng)作為調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫和炎癥平衡系統(tǒng)，與糖尿病的發(fā)生相關聯(lián)，補體C3作為啟動補體活化旁路途徑并參與級聯(lián)反應的重要分子，是預測2型糖尿病的危險因素[2]，其表達水平與胰島素抵抗正相關。T2DM 同正常個體來源的細胞在遺傳學信息，即基因本身方面并沒有不同，什么原因影響了C3的表達呢？本研究通過比較2型糖尿病及健康大鼠來源的脂肪干細胞(ASCs)中C3基因的DNA甲基化水平，探索2型糖尿病機體環(huán)境影響ASCs中C3表達的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

MEM α培養(yǎng)基(HyClone，美國)；胎牛血清(四季青，浙江天杭)；總RNA提取試劑盒(北京天根); 總DNA提取試劑盒、 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(Takara，日本)； 瓊脂糖(Sigma, 美國)； PCR清潔回收試劑盒(Axygen， 美國)； EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(Zymo， 美國)； VAHTS Turbo DNA Library Prep Kit (Vazyme, 美國)； High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, 瑞士)； GeneJET GelExtraction Kit、 CO2孵箱(Thermo，美國)； 倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)。

1.2 ASCs的分離及培養(yǎng)

選取2型糖尿病及正常大鼠，過量麻藥處死。75%酒精浸泡15 min, 無菌條件下取腹股溝處的脂肪組織， 剪碎呈乳糜狀， 0.2%的Ⅰ型膠原酶消化50 min, 過濾取濾液，離心重懸，接種于培養(yǎng)瓶，37 ℃、 5% CO2細胞孵箱培養(yǎng)。換液3 d/次，細胞匯合至80%時傳代。

1.3 干細胞的表面標志物鑒定

取第1 代(P1)的ASCs-T2DM及ASCs-control(C)細胞，胰酶消化離心，完全培養(yǎng)基重懸。將細胞懸液分裝至1.5 ml離心管內(nèi)，控制細胞數(shù)量，使每管細胞數(shù)1×106， 加入抗體CD29, CD90, CD34, CD45， 進行流式檢測。

1.4 ASCs多向分化能力檢測

成脂分化：選P1的ASCs-T2DM及ASCs-C細胞，以2.5×105的密度接種于六孔板內(nèi)，待細胞匯合至80%～90%時，更換成脂誘導液。 14 d天后，多聚甲醛固定,油紅O染色,顯微鏡下觀察并拍照。

成骨分化：選P1的ASCs-T2DM及ASCs-C細胞，以2.5×105的密度接種于六孔板內(nèi)，待細胞匯合至80%～90%時，更換成骨誘導液。誘導28 d后，多聚甲醛固定。0.1%茜素紅染液室溫避光孵育2～3 min，鏡下觀察拍照。

1.5 DNA的提取及全基因組甲基化檢測

選取P1 ASCs-T2DM及ASCs-C細胞，用總DNA提取試劑盒進行DNA提取，提取純度達1.7～2.1，做全基因組甲基化測序。

1.6 q-PCR檢測C3表達

提取P1 ASCs-T2DM及ASCs-C細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄，qPCR檢測C3基因的表達。具體操作步驟參考試劑盒說明書，引物由北京奧科生物合成(表1)。

1.7 PCR檢測C3啟動子區(qū)特定區(qū)域甲基化

表1 qPCR引物序列

選P1 ASCs-T2DM及ASCs-C細胞，用總DNA提取試劑盒進行DNA提取，重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，PCR擴增，PCR產(chǎn)物割膠純化，送測序。

1.8 統(tǒng)計學分析

用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析， 2 組比較采用成組t檢驗， 檢驗水準為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 細胞形態(tài)觀察

原代培養(yǎng)第3 天， 可見細胞逐漸貼壁， 7 d后， 細胞生長融合至80%; 傳代培養(yǎng)后可見P1細胞多為長梭形，多角形或星形; 不同大鼠個體來源的ASCs形態(tài)無明顯差異(圖1)。

2.2 干細胞的表面標志物鑒定

ASCs-T2DM及ASCs-C細胞，均陽性表達干細胞相關的標志物(CD29和CD90)，不表達血細胞相關的標志物(CD34和CD45)(圖2)。 2 種干細胞相關分子表達水平上均無明顯的統(tǒng)計學差異(P>0.05)(圖2)。

2.3 多向分化能力檢測

ASCs-T2DM及ASCs-C細胞經(jīng)誘導均可成脂分化，產(chǎn)生串珠樣脂滴(圖3)。經(jīng)成骨誘導并染色后，發(fā)現(xiàn)2 組細胞均可形成礦化結(jié)節(jié)(圖3)。

2.4 全基因組甲基化檢測

甲基化實驗結(jié)果如圖4顯示：基因啟動子區(qū)甲基化差異的基因共有253 個， 其中C3基因啟動子區(qū)甲基化水平改變顯著。GO分析中，C3基因啟動子區(qū)甲基化差異與免疫及炎癥調(diào)控， 細胞因子分泌，血管生成等顯著相關。IGV可視化軟件分析：ASC-T2DM中C3基因啟動子甲基化水平低于樣本ASC-C，啟動子區(qū)甲基化主要發(fā)生在chr9: 9720616-9721188區(qū)域。

圖1 ASCs-C及ASCs-T2DM形態(tài)學觀察 (倒置顯微鏡，×40)

Fig 1 The morphology of ASCs-C and ASCs-T2DM (Inverted microscope, ×40)

2.5 C3表達對比

q-PCR結(jié)果如圖5顯示：C3基因在ASCs-T2DM中的表達高于ASCs-C, 統(tǒng)計分析顯示兩種細胞C3基因表達有統(tǒng)計學差異(P<0.001)。

2.6 C3啟動子區(qū)特定片段的甲基化對比

2.6.1 PCR電泳 PCR結(jié)果(圖6)及測序結(jié)果(圖7)顯示：來源于ASCs-T2DM的樣本中，C3基因啟動子特定區(qū)域甲基化水平低ASCs-C樣本， 兩者具有顯著差異(P<0.05)。

2.6.2 甲基化差異樹狀聚類圖 對兩樣本C3基因啟動子特定區(qū)域甲基化差異進行聚類分析,結(jié)果如圖8顯示：ASCs-T2DM樣本來源的C3基因啟動子特定區(qū)域甲基化水平處于0～0.5，明顯低于ASCs-C樣本。

圖2 細胞細胞表面標志物檢測

3 討 論

近年來研究表明應用干細胞可以提升糖尿病患者種植體骨結(jié)合[3-4]。相比異體干細胞，自體干細胞具有更好的免疫抑制和長期的移植生存[5]。但來源于糖尿病個體的ASCs再生性能弱于健康個體來源， 其機體環(huán)境對干細胞的性能產(chǎn)生較大影響[6]。

DNA甲基化是表觀遺傳的一種，是連接基因表達和環(huán)境的重要紐帶，具體是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，將甲基加在胞嘧啶的5-碳端，從而形成5甲基胞嘧啶[7]。DNA甲基化可出現(xiàn)在整個基因區(qū)域，但不同區(qū)域?qū)虮磉_的影響不同。而出現(xiàn)在基因啟動子區(qū)的DNA甲基化，一般會抑制基因的表達[8]。

研究發(fā)現(xiàn),DNA甲基化的改變對于糖尿病等代謝性疾病具有重要意義，糖尿病環(huán)境可引起DNA總體甲基化水平的改變[9]。而特定與糖尿病相關基因的甲基化檢測結(jié)果顯示，糖尿病機體環(huán)境與特定基因甲基化密切相關[10]。除此之外，DNA甲基化與干細胞分化的關系也被廣泛研究[11-12]。

脂肪組織在免疫調(diào)節(jié)，炎癥控制，骨量維持等方面，具有重要作用[13]。來源于脂肪組織的ASCs，分泌多種促血管生成和抗凋亡因子， 發(fā)揮抗炎、 抗氧化的作用。但是糖尿病個體來源的脂肪組織，其分泌的細胞因子顯著改變[14]。同時，糖尿病大鼠來源的ASCs相比正常大鼠ASCs,其增殖分化、促進細胞更新和自發(fā)修復、免疫調(diào)節(jié)能力顯著下降[15]。為探究糖尿病機體環(huán)境對ASCs基因表達的影響，我們引入表觀遺傳的重要部分-DNA甲基化，選取來自T2DM及正常大鼠的ASCs,探究DNA甲基化在兩者中的差異。

全基因組甲基化測序結(jié)果顯示， 基因啟動子區(qū)甲基化差異基因共有253個，其中C3基因啟動子區(qū)甲基化差異較為顯著。GO分析表明，C3甲基化差異與免疫功能調(diào)節(jié)，炎癥因子分泌，血管生成顯著相關。為了驗證甲基化水平與基因表達的負性調(diào)控關系，我們進一步在轉(zhuǎn)錄水平檢測2 組細胞C3的表達，結(jié)果顯示，糖尿病大鼠來源的ASCs中C3基因表達量顯著高于正常大鼠來源的ASCs，而其啟動子區(qū)甲基化水平低于ASCs-C樣本，此結(jié)果進一步證實DNA甲基化水平確實影響C3基因的表達。但是2型糖尿病機體環(huán)境是否一定能引起C3基因啟動子區(qū)甲基化水平穩(wěn)定的改變？后期試驗中直接選取在全基因組測序結(jié)果檢測得到的C3啟動子區(qū)甲基化水平改變片段，重新提取糖尿病及正常大鼠ASCs DNA，進行特定片段的甲基化水平檢測， 證實在此片段出現(xiàn)甲基化水平差異。充分說明，糖尿病機體環(huán)境降低了C3基因啟動子區(qū)特定片段甲基化水平，進而使C3基因表達水平增加。

圖3 油紅O和茜素紅染色 (倒置顯微鏡，×100)

Fig 3 Oil red and alizarin red staining (Inverted microscope, ×100)

圖4 ASCs-C及ASCs-T2DM中C3啟動子區(qū)甲基化差異(IGV可視化對比)

Fig 4 Methylation difference in C3 promoter region in ASCs-C and ASCs-T2DM (IGV visual contrast)

圖5 C3基因的表達 圖6 C3基因甲基化PCR電泳結(jié)果 圖7 C3基因啟動子測定區(qū)域甲基化箱線圖

Fig 5 C3 genes expression Fig 6 PCR results of methylated C3 Fig 7 Methylation boxplot of C3 gene promoter area

補體C3可參與脂質(zhì)代謝，同時其作為補體系統(tǒng)重要一員，調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫和炎癥的平衡，并與胰島素抵抗及糖尿病的發(fā)生相關聯(lián)。一方面，單純糖尿病會導致C3水平升高，進而引發(fā)糖尿病患者的高炎癥狀態(tài)[16]。另一方面C3及活化產(chǎn)物可沉積在糖尿病患者血管內(nèi)，形成循環(huán)免疫復合物，導致2型糖尿病血管病的產(chǎn)生[17]。對于口腔種植而言，糖尿病的機體高炎癥以免疫缺陷狀態(tài)影響患者口腔健康狀態(tài)和種植治療，而其血管功能障礙會進一步阻礙種植體骨結(jié)合。

脂肪來源的ASCs是具有再生功能的干細胞，不僅可以進行免疫調(diào)節(jié)， 細胞因子分泌等[18]， 近些年來在骨再生等組織再生方面有重要應用。但來源于T2DM的自體ASCs在增殖及分化，及相關基因表達上與ASCs-C顯著不同，而機體環(huán)境是引起此種差異的重要原因[15]。為了探究環(huán)境對于基因表達影響的機制，我們引入表觀遺傳-DNA甲基化的概念，通過全基因組測序結(jié)合基因表達分析，驗證了前期實驗假說，并通過二次特定序列甲基化測序，進一步確定DNA甲基化在特定片段發(fā)生穩(wěn)定的改變。實驗結(jié)果為進一步探究并提升自體ASCs的應用奠定了基礎，以期后期應用基因編輯技術特異性改造DNA甲基化改變片段，改善自體干細胞的再生性能，獲得更佳的應用效果。

圖8 C3基因啟動子測定區(qū)域甲基化水平樹狀聚類圖(橫坐標：CG位點；每個樣本為一行；位點甲基化水平用不同灰度方塊代表)

Fig 8 Methylation dendrogram of C3 gene promoter area(Abscissa: CG locus; Each sample is a row; Site methylation level represented by squares of different grayscale)