紫地榆中4 種單體對3 種致齲菌抑菌活性的初步研究

李夢琪 藍海

現代研究表明，人類齲病最重要的致病因子主要分為鏈球菌屬(Mutans streptococci)、乳桿菌屬(Lactobacillus Beijerinck)和放線菌屬(Actinomyces)[1-3]。現選取鏈球菌屬中的變形鏈球菌、放線菌屬中的粘性放線菌、乳桿菌屬中的嗜酸乳桿菌進行實驗。

紫地榆(Geraniumstrictipes)是牻牛兒苗科老鸛草屬植物，藥用部位為根，民間稱隔山消。前期實驗證明，紫地榆的乙酸乙酯、正丁醇等部位對致齲菌具有抑制作用[4-6]。從紫地榆中分離的物質包括沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸、兒茶素、β-1,4,6-三-O-沒食子酰基-葡萄糖(Ⅰ)、β-1,6-二-O-沒食子酰基-葡萄糖(Ⅱ)、 3, 4-二羥基苯甲酸(Ⅶ )等12 種成分[7-8]。現選取含量較高的沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸、兒茶素4 種單體對3 種致齲菌變形鏈球菌、粘性放線菌、嗜酸乳桿菌的抑菌活性及機制進行初步研究，為更好的研究紫地榆對致齲菌的作用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種為變形鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans) ATCC 25175、 粘性放線菌(Actinomycesviscosus,A.riscosus) ATCC 277044、 嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus,L.acidophilus) ASI.1854(廣東省微生物菌種保藏中心)； 沒食子酸、沒食子酸甲酯標準品(山東西亞化學股份有限公司)； 兒茶素標準品(上海源葉生物科技有限公司)； 鞣花酸標準品(上海麥克林生化科技有限公司)； 胰酶解酪蛋白-植物蛋白胨-酵母提取物(Trypticase-phytone-yeast extractm edium,TPY)固體及液體培養基、MRS固體及液體培養基(青島海博生物技術有限公司)。

1.2 儀器

立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)； 隔水式恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)； TGL-16A高速離心機(常州邁科諾儀器有限公司)； 超凈臺(蘇州市金凈凈化設備科技有限公司)； 2.5 L圓底立式厭氧培養袋(青島海博生物技術有限公司)； 酶標儀(BIO-Tek公司， SynergyTMHT， 美國)、雷磁DDS-11A 數顯電導率儀(上海雷磁創益儀器儀表有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 菌液的制備 在37 ℃、 80% N2， 20% CO2、厭氧條件下用TPY固體培養基(嗜酸乳桿菌用MRS液體培養基)培養復蘇48 h后的菌種培養18 h。 通過生化鑒定及涂片檢查為純培養后，分別挑取單個菌落于TPY液體培養基(嗜酸乳桿菌用MRS液體培養基)在相同條件下培養18 h增菌，使用麥氏比濁管調整菌懸液濃度至0.5 McFarland(108cfu/ml)備用[9]。

1.3.2 紫地榆中4 種單體對3 種致齲菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定 將沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸、兒茶素分別按2 倍稀釋法溶于TPY液體培養基(嗜酸乳桿菌用MRS液體培養基)中，使藥物濃度分別為0.25、 0.5、 1、 2、 4、 8、 16、 32、 64、 128 mg/ml。 取2 ml含藥培養液于試管中，加入1.3.1預備好的菌液20 μl后，置37 ℃、 80% N2， 20% CO2、厭氧條件靜置培養48 h，以肉眼觀察無細菌生長的最低藥物濃度為其MIC值[10]。選擇大于MIC濃度的各管，分別取20 μl涂布于TPY固體培養基(嗜酸乳桿菌用MRS固體培養基)上， 37 ℃、 80% N2， 20% CO2、 厭氧條件靜置培養48 h， 觀察菌落數少于5～6 個的最低殺菌濃度為其MBC[11]，實驗重復3 次。

1.3.3 紫地榆中4 種單體對3 種致齲菌的生長曲線的影響[12-13]根據沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸、兒茶素對3種細菌的MIC和MBC的測定結果，選取MIC值以下的4 個濃度梯度配制成TPY液體培養基(嗜酸乳桿菌用MRS液體培養基)。按菌懸液與TPY液體培養基(嗜酸乳桿菌用MRS液體培養基)比例為1∶10(V/V)比例接種此菌后， 置37 ℃、 80% N2, 20% CO2、厭氧條件下搖動培養。在0～48 h內，每隔4 h取樣一次，用酶標儀在630 nm處測定其A值，并計算其細菌數，繪制生長曲線。實驗設陰性對照組和陽性對照組。陰性對照組為不含藥物的培養基中的細菌數，陽性對照組為含0.05% 洗必泰的培養基中的細菌數。每組有3個平行管，實驗重復3次。

1.3.4 紫地榆中4 種單體對3 種致齲菌的培養液電導率的影響[14-15]根據沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸、兒茶素對3 種細菌的MIC和MBC的測定結果，選取MIC值以下的4 個濃度梯度配制成TPY液體培養基(嗜酸乳桿菌用MRS液體培養基)。按菌懸液與TPY液體培養基(嗜酸乳桿菌用MRS液體培養基)比例為1∶10(V/V)比例接種此菌后，置37 ℃、 80% N2, 20% CO2、厭氧條件下搖動培養。分別取培養至1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 h的培養液1 ml， 3 000 r/min離心15 min，將上清液稀釋20 倍后，用電導儀測定其電導率。實驗設立陰性對照組和陽性對照組。陰性對照組為不含藥物的培養基對細菌電導率的影響，陽性對照組為含0.05% 洗必泰的培養基對細菌電導率的影響。每組有3 個平行管，實驗重復3次。

2 結 果

2.1 4 種單體對3 種致齲菌的MIC和MBC的測定

結果見表1。

2.2 4 種單體對3種致齲菌的生長曲線的影響

實驗結果：由圖1可以看出4 種單體對3 種致齲菌的生長均有抑制作用，且在細菌的生長對數期的抑制作用最強，抑制作用隨濃度的增加而增大，而且藥物作用細菌后細菌數明顯比空白組低，細菌進入衰亡期的時間明顯提前，衰亡速度明顯加快。 4 種單體對變形鏈球菌的細菌數抑制作用最強的是鞣花酸0.5 mg/ml、 4 種單體對粘性放線菌的細菌數抑制作用最強的是沒食子酸2 mg/ml、 4 種單體對嗜酸乳桿菌的細菌數抑制作用最強的是兒茶素1 mg/ml。

表1 紫地榆中4 種單體對3 種致齲菌的MIC和MBC的測定

a: 空白對照； b: 陽性對照( 洗必泰0.05%)

2.3 紫地榆中4種單體對3種致齲菌的培養液電導率的影響

結果：細胞膜通透性改變會引起細胞內K+、 Na+等小分子物質外流，使培養液的電導率發生變化。因而可以用培養液電導率的變化反推細胞膜通透性的變化。 4 種單體作用于3 種致齲菌后細菌培養液的電導率增大，隨濃度增大電導率增加(圖2)。 對變形鏈球菌的電導率影響效果最大的是沒食子酸2 mg/ml， 對粘性放線菌的電導率影響效果最大的是鞣花酸0.25 mg/ml， 對嗜酸乳桿菌的電導率影響效果最大的是鞣花酸0.5 mg/ml。

3 討 論

本實驗對紫地榆中的4 種單體對3 種致齲菌的抑菌活性進行了研究，結果顯示不同濃度的沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素、鞣花酸對3 種致齲菌均有抑制作用，且抑制作用隨濃度的增加而增大。根據紫地榆中4 種單體對3 種致齲菌的MIC和MBC，用于臨床時的安全劑量可以選擇MIC50作為參考值。藥物的抑菌作用是通過破壞細菌細胞膜的完整性來實現的。本實驗的結果表明，沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素、鞣花酸4 種單體使3 種致齲菌的細胞膜的通透性增加，推測其原因可能是沒食子酸等4 種單體誘導菌體產生了某些酶，降解了細胞膜，或者是藥物與菌體細胞膜結合，改變了細胞膜的通透性，使細胞內物質外漏。但本實驗并未對培養液中的大分子物質進行測定，不能確定對細胞膜的完整性是否有影響。

綜上所述，不同濃度的沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素、鞣花酸對變形鏈球菌、粘性放線菌、嗜酸乳桿菌均有抑制作用； 其抑菌機制可能是通過改變細菌細胞膜的通透性來實現的； 但對細胞膜的完整性需進一步研究。希望本研究能夠對齲病的進一步研究和開發新型防齲藥物提供幫助。

a: 空白對照(培養基)； b: 陽性對照( 洗必泰0.05%)