施萬細胞通過NT-3/TrkC信號通路促進SACC嗜神經侵襲的研究

郭佳 李歡 王珺 雷德林 楊新杰

唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma， SACC)約占唾液腺惡性腫瘤的30%[1]。嗜神經侵襲(perineural invasion，PNI)特性是其顯著的生物學特征之一。PNI常導致患者出現頭痛、感覺麻木、面癱等周圍神經受損癥狀[2]。有研究表明，SACC的PNI不僅破壞被侵襲神經的結構與功能，還成為腫瘤侵襲和代謝的新機制[3]。但其明確的發生、發展機制至今仍未完全闡明。因此，對SACC的PNI特性的深入研究是改善SACC預后的關鍵。

相關研究表明，神經周圍的腫瘤微環境能夠提高腫瘤的侵襲力[4]。施萬細胞(Schwann Cells, SCs)作為腫瘤微環境的一個關鍵因素，能影響腫瘤微環境的變化[5]。課題組過去的研究發現Slug、EMMPRIN和E-cadherin在SACC中的表達與SACC的臨床病理特征密切相關[6]，此外BDNF/TrkB信號通路影響SACC細胞與SCs之間的相互作用，誘導SACC細胞的EMT和施萬細胞樣分化過程，增強其神經侵襲能力[7]。另外，有研究發現SCs出現在胰腺癌和結腸癌的腫瘤侵襲邊界，這表明在PNI過程中是神經而非腫瘤首先遷移[8]。以上研究表明SCs被視作SACC嗜神經侵襲行為的早期啟動者，對腫瘤細胞的信號作出應答，在PNI過程中發揮重要作用。同時，有研究表明在有PNI現象的胰腺癌和前列腺癌中發現NT-3的過表達[9-10]。也有研究發現NT-3激活SACC細胞的TrkC特異性受體，通過下游Ras、Erk1/2、Ark和Bcl信號通路來提高SACC的侵襲能力[11]。PNI的生物學機制十分復雜，目前關于腫瘤-神經之間復雜的信號轉導的研究仍處于起步階段。本實驗采用SACC細胞與SCs共培養、Transwell 嗜神經侵襲實驗及3D共培養實驗及相關檢測，旨在驗證NT-3/TrkC 信號通路在SACC 嗜神經侵襲過程中發揮的重要作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

唾液腺腺樣囊性癌細胞系SACC-83(北京大學口腔醫學院); NT-3抗體(1∶5 000)、 TrkC(1∶2 000)、 β-actin(1∶2 000)(GeneTex公司，美國); Goat Anti-Mouse IgG HRP二抗(1∶5 000， Affinity，美國)， NT-3細胞因子(20 ng/ml， PeproTech公司，美國)； Transwell 小室(0.4 μm，Corning公司，美國)； Duoset?ELISA試劑盒(R&D公司，美國)；EpochTM超微量微孔板分光光度計(BioTek公司，美國)； RNA提取試劑盒、 逆轉錄試劑盒(Takara Bio公司，日本)； 熒光定量PCR儀(BIBBY PrimeQ，英國)； ChemiDocTMXRS+ Image LabTMSoftware(BIO-RAD，美國)； 倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.2 細胞培養

唾液腺腺樣囊性癌細胞系SACC-83培養于含10%胎牛血清RPMI-1640 培養基，置37 ℃， 5% CO2培養箱。 SCs的原代培養取SD 大鼠仔鼠(1～3 d)坐骨神經， 0.25%胰酶消化(不含EDTA)，接種于預先多聚賴氨酸(PLL)包被的培養瓶，培養于含10%胎牛血清RPMI-1640 培養基，置37 ℃、5%CO2培養箱。經消化法原代培養的SCs采用差速貼壁法分離純化。

1.3 SACC-83細胞和SCs共培養

采用Transwell共培養系統，孔徑0.4 μm，共培養小室下層接種SACC-83細胞(密度1×104/cm2)，上層用多聚賴氨酸預包被后接種SCs(密度1×105/cm2)。起初在6 孔板上室接種SCs，待其完全貼壁后更換無血清培養液繼續培養12 h，后與接種于下室的SACC-83(SACC-83 細胞與SCs同步饑餓處理)共培養，更換含0.1% BSA 的RPMI-1640 培養液。72 h 后收集共培養前后的腫瘤細胞與SCs，實驗重復3 次。

1.4 ELISA檢測

采用Duoset?ELISA試劑盒進行NT-3 的ELISA 檢測。實驗步驟按照產品說明書進行，分別將100 μl待測細胞培養液和不同濃度標準品加入相應的孔中，置37 ℃， 40 min，洗板5 次，后依次加入生物素化的抗體，HRP標記的鏈酶卵白素，TMB底物反應相應時間，中途洗板5 次，加入終止液，混勻后用EpochTM超微量微孔板分光光度計測量A值，測量波長為450 nm。標準曲線縱坐標為標準品濃度, 橫坐標為A值，根據標準曲線計算出NT-3 含量。

1.5 RT-PCR

SACC-83細胞及SCs中的總RNA使用RNA提取試劑盒提取，并測量各組樣本RNA 的濃度和純度(EpochTM超微量微孔板分光光度計)； 采用逆轉錄試劑盒對總RNA進行反轉錄，并采用熒光定量PCR儀以及PCR檢測試劑盒進行檢測。其中NT-3、TrkC和β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司定制合成，具體序列見表1。以β-actin為參照基因，測得共培養前后SACC-83細胞和SCs中NT-3、TrkC基因的相對表達量，繪制柱狀圖。

表1 PCR所用引物序列

注： F: 上游引物; R: 下游引物

1.6 Western blot

提取各組細胞總蛋白, 蛋白定量采用BCA 蛋白質定量試劑盒。常規電泳轉膜后封閉，用NT-3、TrkC和β-actin 4 ℃孵育過夜，洗膜，Goat Anti-Mouse IgG HRP二抗(1∶5 000，Affinity)室溫孵育1 h，洗膜，ECL發光，用ChemiDocTMXRS+Image LabTMSoftware檢測蛋白條帶的灰度值，目的蛋白表達的相對水平為目的蛋白灰度值與內參灰度值的比值。

1.7 劃痕實驗

SACC-83 細胞被接種于Transwell 小室下室，上室依次為空白對照、SCs和NT-3。實驗依照劃痕實驗標本步驟進行， 24 h后倒置相差顯微鏡下采集圖片，測量各個組腫瘤細胞的移動距離。

1.8 Transwell嗜神經侵襲實驗

SACC-83細胞 (5×104/cm2) 和SCs (5×105/cm2)分別被接種于Transwell小室的上下室，模擬腫瘤神經相互作用。24 h后，沒有遷移的細胞被擦除，依次進行PBS緩沖液漂洗，95%乙醇固定，結晶紫溶液染色。倒置相差顯微鏡下隨機選取5 個獨立視野，計數各個組穿過Transwell膜的細胞數量。

1.9 3D共培養實驗

SACC-83細胞(5×103/cm2)和SCs(5×103/cm2)分別與細胞外基質混合，相鄰培養組之間的距離為1 mm。實驗利用ECM連接橋產生化學吸引梯度。NT-3 (20 ng/ml)和不含細胞的ECM混合來模擬SACC-83細胞微環境中高表達NT-3細胞因子，不含細胞成分的ECM作為空白對照。72 h后，倒置相差顯微鏡下觀察各組連接橋處的細胞情況。

1.10 統計分析

實驗重復3 次， 實驗結果用SPSS 19.0軟件包進行統計學處理，采用單因素方差分析比較各組中NT-3、TrkC 的表達差異；劃痕實驗中SACC-83細胞的遷徙距離和Transwell嗜神經侵襲實驗中穿膜細胞數的差異采用t檢驗或χ2檢驗。P<0.05具有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞培養

SACC-83和SCs細胞正常生長(圖1)。

2.2 SACC-83細胞和SCs相互作用下NT-3和TrkC的表達

采用ELISA測定培養液中NT-3的濃度，結果顯示共培養組的NT-3濃度顯著高于單獨培養組(P<0.05)，共培養SACC-83細胞組的NT-3的增幅顯著大于共培養SCs組的增幅(P<0.05)(圖2A)。

圖1 細胞形態 (倒置顯微鏡， ×200)

Fig 1 Cell morphology (Inverted microscope, ×200)

RT-PCR和Western Blot的結果顯示共培養SACC-83細胞組中NT-3基因和蛋白水平的表達量均顯著升高(P<0.05)(圖2B、 2D)。共培養SACC-83細胞組中TrkC基因和蛋白水平的表達量略有升高(P<0.05)(圖2、 2D)。而且共培養組SCs的TrkC基因和蛋白水平的表達量顯著升高(P<0.05)(圖2C、 2D)，NT-3基因和蛋白水平的表達量略有升高(P<0.05)(圖2C、 2D)。

圖2 SACC-83細胞和SCs相互作用時，NT-3和TrkC的表達情況

2.3 SACC細胞和SCs相互作用下侵襲遷移能力

劃痕實驗表明，共培養腫瘤細胞組以及NT-3處理組的遷移能力顯著高于單獨培養組(P<0.05)(圖3A)。 同時，SACC-83細胞共培養組，SCs共培養組和NT-3處理組的侵襲能力明顯高于其單獨培養組(P<0.05)(圖3C、3D)。

3D共培養實驗觀察SACC-83細胞和SCs的相互作用過程，結果表明，在SACC-83細胞侵襲SCs之前，SCs已經早期定向趨化遷移至腫瘤細胞，與此同時SCs也向NT-3 高濃度區發生有規律的移動，而對照組沒有發現此現象(圖3B)。

3 討 論

SACC嗜神經侵襲的微環境由許多細胞成分組成[12-13]。SCs作為腫瘤微環境的一個關鍵因素， 能夠影響腫瘤微環境的變化[5]。有研究發現SCs出現在胰腺癌和結腸癌的侵襲邊界。這個獨特的現象表明，與腫瘤侵襲神經的傳統假設相反，胰腺癌和結腸癌的PNI過程中，神經細胞首先向腫瘤遷移，即除了腫瘤對神經的單方面侵襲之外，在PNI過程中SCs的早期主動參與也起了極為重要的作用。許多研究表明腫瘤和神經周圍的微環境不僅支持腫瘤生長、增殖和擴散，還有助于SCs的早期遷移[4-5]。

圖3 共培養細胞的遷移和侵襲能力(A、 C、 D： ×100; B: ×200)

NT-3是神經營養因子家族的一個可溶性小分子蛋白，有調節多種神經細胞發育、生長和再生的功能[14]。有研究表明，NT-3及其受體TrkC在胰腺癌[9，15]和結腸癌[16]中過表達。本研究發現，共培養組NT-3和TrkC的表達較單獨培養組顯著升高，這提示NT-3和TrkC在腫瘤-神經相互作用中發揮著關鍵作用。已有研究發現，在NT-3的刺激下，TrkC發生酪氨酸磷酸化，激活下游信號，細胞向著NT-3發生趨化移動[11]。有研究表明NT-3對背根神經節軸突有趨化作用[17]，并且NT-3/TrkC信號通路能顯著增強SCs的遷移，但NGF和BDNF都沒有這個能力[18]。3D培養系統為細胞提供基質，和體內細胞的生長環境非常相似[19]。因此，3D培養系統不僅能維持體內細胞微環境的物質基礎，還可直觀反映和控制細胞培養的條件。本研究的3D培養實驗發現，在SACC-83 細胞侵襲SCs之前，SCs已經早期定向趨化遷移至腫瘤細胞，與此同時SCs也向NT-3 高濃度區發生有規律的移動，而對照組沒有發現此現象； 有趣的是， 觀察到早期幾乎沒有SACC-83向SCs遷移。

本實驗采用3D培養系統模擬出腫瘤細胞早期嗜神經侵襲的進程。NT-3在腫瘤-神經相互作用中高表達，同時，通過激活特異性受體TrkC，促進SCs向NT-3高濃度區域遷移，即NT-3介導神經和腫瘤之間的相互作用，從而啟動腫瘤的嗜神經侵襲。實驗證實NT-3及其受體TrkC 介導了SACC 與神經組織內的SCs的相互吸引和遷移作用，從而在SACC 嗜神經侵襲中發揮重要調控作用。涎腺腺樣囊性癌可以分泌一定濃度的NT-3，并且表達NT-3 的高親和力受體TrkC。故在腫瘤周圍形成了以SACC 為中心的NT-3濃度梯度。而NT-3 結合于SCs上的TrkC 受體，能顯著增強SCs的遷移能力，故SCs于腫瘤嗜神經侵襲發生之前先趨化運動至腫瘤細胞，而后刺激腫瘤細胞分泌大量的NT-3。NT-3 作用于SACC 細胞增強其侵襲遷移能力，并可作用于SCs，誘導SCs向腫瘤方向趨化生長。

本研究初步表明，SACC和SCs的相互作用促進了NT-3在腫瘤微環境的表達與分布，同時NT-3/TrkC信號通路可能介導了SCs向腫瘤細胞的遷移，因此促進了嗜神經侵襲的發生。但是，NT-3/TrkC信號通路是否為嗜神經侵襲的唯一通路，以及阻斷此通路能否阻斷PNI進程仍需進一步的研究。