CKIP-1對小鼠皮膚纖維化及TGF-β1和collagen-1表達的影響

胡奧 劉富偉 李云鵬 唐明玥 張晏源 黃鑫 靳丹 侯燕 高曄 孔亮

皮膚是人體最大的器官，其真皮層受損后引起的纖維化，常導致外觀和功能受損[1]。而纖維化的主要病理特征是大量細胞外基質沉積，尤其是在組織重構期，Ⅰ型膠原逐漸替代Ⅲ型膠原，交叉偶聯增加[2-3]。皮膚纖維化疾病如增生性瘢痕，一直是頜面外科領域的難題[4]。

轉化生長因子-β1(TGF-β1)是最具代表性的纖維化促進因子，其參與真皮纖維化等多種纖維化疾病的進程[5]。近年來發現的酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2 interaction protein 1, CKIP-1)被證實可以增強smurf1的活性，繼而降解TGF-β1的底物smads蛋白，從而抑制TGF-β1的活性[6-7]。因此本實驗旨在探究CKIP-1能否通過TGF-β1，從而影響皮膚的纖維化作用，為瘢痕修復機制研究提供新的切入點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取選取6 對6 月齡同窩雄性基因敲除型小鼠CKIP-1 knockout mice(KO)及野生型(WT)小鼠做配對實驗，CKIP-1基因敲除小鼠由CKIP-1雜合子C57小鼠(軍事科學院構建)交配構建。

1.2 組織病理學觀察

取6月CKIP-1基因敲除小鼠和野生型小鼠腹部皮膚并予以4%中性甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，切片。

HE染色：常規HE染色， 中性樹膠封片；顯微鏡鏡檢，圖像采集分析；測量表皮層厚度(×400)和真皮層厚度(×100)，統計KO組和WT組差異。

Masson染色：常規Masson染色， 中性樹膠封片；顯微鏡鏡檢，圖像采集分析；用Image Pro-Plus 6.0分析軟件定量分析膠原面積百分比(×200)，統計KO組和WT組差異。

1.3 免疫組化染色

皮膚經4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片， TGF-β1、collagen-1抗體(武漢塞維爾生物科技有限公司)孵育，用二步法EnVision,DAB顯色(武漢塞維爾生物科技有限公司)，進行免疫組化染色；分別計算TGF-β1、collagen-1分子表達情況(×200)，用Image Pro-Plus 6.0分析軟件定量分析。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件進行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為有顯著性差異。

2 結 果

2.1 大體觀察

KO組小鼠體型稍大，皮膚偏硬、彈性較差，毛發發白、無光澤；WT組小鼠體型稍小，皮膚柔軟、彈性較好，毛發順滑、有光澤(圖1)。

圖1 小鼠大體形態

2.2 皮膚組織病理學觀察

HE染色結果顯示WT小鼠皮膚組織無明顯病理改變(圖2A、 2B)。KO小鼠皮膚出現明顯的纖維化改變(圖2C、2D)，具體表現為表皮層增厚，統計有顯著性差異[圖2E(32.59±9.8) μm， (53.33±9.48) μm，P<0.01]，尤其是角化增厚明顯、且不規則(圖2D箭頭示)；真皮層增厚，差異有統計學意義[圖2F(555.60±104.11) μm，(423.63±27.15) μm，P<0.05]，膠原纖維束扭曲、增粗，排列緊實。

2.3 皮膚纖維化程度

Masson染色結果顯示KO組膠原纖維束更粗，排列更緊密(圖3)； KO組和WT組小鼠皮膚膠原面積百分比分別為69.44%±1.42%和46.09%±7.6%(P<0.01)(圖3)。

2.4 分子表達情況

免疫組化染色結果顯示collagen-1均在KO組和WT組真皮層全層均勻表達(圖4A、 4B)，KO組和WT組的collagen-1表達分別為4.70±0.62和30.29±0.71(圖4E)(P<0.01)；TGF-β1在KO組和WT組表皮層及真皮層均表達，但KO組TGF-β1表達不均勻，在真皮層與表皮層交界處表達增加顯著(圖4C、4D)； TGF-β1在KO組表達分別為4.76±0.68和10.03±1.59(圖4F)(P<0.01)。

3 討 論

皮膚纖維化疾病的主要病理表現為早期表皮增厚，真皮層均一化膠原纖維增多，晚期表皮萎縮，膠原纖維增厚、硬化，膠原蛋白過度沉積[8]。其中，粗大的Ⅰ型膠原是皮膚纖維化的物質基礎，它的增生貫穿于整個纖維化形成過程，是纖維化皮膚有別于正常皮膚的重要病理標志[9]。纖維化信號通路及其相關蛋白的表達和調控異常在纖維化發病機制中起著重要作用。TGF-β1被認為是組織纖維化中的關鍵調節因子，它能通過激活下游的Smad信號[10]，促進血管形成、成纖維細胞增生、肌成纖維細胞分化、基質沉積、膠原合成，從而引起組織瘢痕形成[11]。在TGF-β1高表達的轉基因小鼠模型中，TGF-β1在角質形成細胞中表達更加顯著，Ⅰ型膠原表達上調，瘢痕組織增生更明顯[12]。因此，通過調控TGF-β1的表達、抑制Ⅰ型膠原的過度增生從而抑制瘢痕形成在理論上是可行的。

近年來發現的CKIP-1是潛在的纖維化抑制因子。首先，其可能是TGF-β1的負性調節因子。Smads蛋白是TGF-β1信號轉導中重要的下游調控蛋白，多項研究證實CKIP-1可以作用于Smads蛋白，從而調控細胞的增殖、 分化、 遷移等[13-14]。并且CKIP-1是首個被發現可以調節泛素連接酶Smurf1活性的因子，而該細胞因子被發現可以降解Smads蛋白[15]。郭寶生等[7]在觀察大鼠軟骨CKIP-1和TGF-β1表達時發現，隨著年齡的增加CKIP-1表達水平升高，而TGF-β受體1表達下降；劉富偉等[16]在CKIP-1基因敲除小鼠軟骨組織中發現類似表型，即基質減少，膠原較少，軟骨細胞增殖和分化異常；王禮鑫[17]通過分析犬前列腺尿道創面修復后期TGF-β1和CKIP-1的表達發現CKIP-1表達增加，TGF-β1表達降低；過表達CKIP-1的BPH-1細胞TGF-β1表達降低。除此之外，CKIP-1能通過激活腎小球系膜細胞中的Nrf2/ARE信號通路從而抑制腎臟纖維化[18]；CKIP-1還能上調HDAC4的脫磷酸作用而抑制心肌纖維化[19]。盡管CKIP-1抑制不同組織纖維化的機制有差異，但由于TGF-β1是與皮膚纖維化關系最密切、最具代表性的細胞因子[10]，因此，我們推測CKIP-1可能通過調控TGF-β1，調節Ⅰ型膠原合成，從而影響皮膚纖維化及瘢痕形成。

圖2 小鼠皮膚組織學變化 (HE)

Fig 2 Histology changes of mice skin (HE)

圖3 小鼠皮膚膠原含量比較 (Masson染色, ×200)

Fig 3 Comparison of collagen content in mice skins (Masson staining, ×200)

本研究利用基因敲除小鼠和組織病理學分析，首次發現CKIP-1敲除后小鼠皮膚出現明顯的纖維化改變，即皮膚角化增加，表皮層、真皮層增厚，膠原纖維扭曲、增粗，排列更密實；隨后通過Masson染色定量分析了膠原含量，發現KO組膠原含量顯著增加；最后通過免疫組化檢測了細胞因子TGF-β1、collagen-1的表達情況，發現CKIP-1敲除后小鼠皮膚的TGF-β1、collagen-1的表達顯著增加，這也驗證了我們之前的推測。本實驗還發現，TGF-β1在真皮層與表皮層交界處表達增加顯著，針對這一點主要考慮可能的原因是表皮干細胞在細胞因子的作用下分化為成纖維細胞， 成為真皮成纖維細胞的一個重要來源[20]，而TGF-β1的表達主要集中在增生最活躍的區域，因此，表皮可能是皮膚纖維化疾病的參與者之一。

圖4 小鼠皮膚免疫組化染色 (×200)

Fig 4 Immunohistochemistry of the mice skin (×200)

雖然本課題研究結果表明CKIP-1在調控皮膚纖維化中可能的機制之一是通過TGF-β1來實現，但是尚不明確是否有其它細胞因子或者通路參與其中，也不清楚CKIP-1在多個組織纖維化作用機制中是否有關聯。另外，本實驗僅針對6月齡小鼠進行對照研究，不確定CKIP-1對不同年齡小鼠皮膚的影響是否一致。隨著對CKIP-1基因研究的不斷深入，其在纖維化作用中的機制不斷闡明，將為治療纖維化疾病如增生性瘢痕提供新的思路和靶標。