針刺百會、四神聰對MCAO模型大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α的影響

趙秋陽，馬賢德

腦梗死屬缺血性腦病之一，又叫做缺血性卒中，中醫稱為中風。近年來的研究表明，炎癥、凋亡、氧化應激等均在腦梗死的發生發展過程中發揮了重要作用[1-2]。這一研究成果為腦梗死的多靶點治療提供了理論依據。百會穴具有醒腦開竅，回陽固脫之功效。四神聰位于百會前、后、左、右各開1寸處，名為四神聰。《圖翼》中記載：前神聰主治中風、風癇……后神聰同。研究顯示，百會、四神聰配合針刺，對腦梗死患者認知功能障礙具有一定的改善作用[3]。另有文獻報道，針刺百會穴對線栓法大鼠大腦中動脈缺血 (middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠血清細胞因子具有一定調控作用，此外該穴位在癲癇等疾病的治療中也具有調控細胞因子的作用[4-6]。本研究擬通過線栓法制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，然后給予針刺百會、四神聰穴干預，觀察缺血半暗帶腦組織中白細胞介素1(interleukin-1, IL-1)、白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)的含量，探討針刺百會、四神聰穴對MCAO模型大鼠的抗炎作用。

1 材料和方法

1.1 材料 ①實驗動物：SPF級SD大鼠60只，購自遼寧長生生物科技有限公司(實驗動物生產許可證號：SCXK(遼)2010-0001)，體質量270～330g。實驗動物購入后，于遼寧中醫藥大學實驗動物中心飼養，飼養環境為SPF級，實驗動物飼養許可證號：SYXK(遼)2013-0009。以常規顆粒飼料喂養，自由飲水，12h晝夜節律，適應性飼養1周。②實驗試劑及儀器設備： IL-1、IL-6、TNF-α檢測試劑盒均由武漢優爾生商貿有限公司生產，貨號分別為：SEA563Ra、SEA079Ra、SEA133Ra。酶標儀，Thermo生產；移液器，Thermo生產；恒溫水浴振蕩器，常州國華儀器設備廠生產。

1.2 方法 ①實驗分組：首先將大鼠按照體質量進行標記1～60號，然后采用隨機數字法，將大鼠分為假手術組(15只)和造模組(45只)。然后采用改良線栓法對造模組45只大鼠進行CIRI模型復制，評價模型成功后，再將成功的動物模型隨機分為2組：非穴區對照組和針刺組。最終實驗分為3組：即假手術組、非穴區對照組和針刺組。②模型復制：造模組大鼠采用線栓法復制腦缺血再灌注模型，方法參考馬賢德等[7]的文獻，假手術組大鼠實施相同術式，但釣魚線插入深度為1cm，不造成實質性栓塞。③模型評價：再灌注后2h，大鼠完全蘇醒后，參考Bederson等[8]的5分制神經功能缺損評價標準進行評分，評分標準如下：0分為無癥狀；1分為不能完全伸展對側前爪；2分為向對側轉圈；3分為向對側傾倒；4分為不能自發行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實驗組，未達標準者排除。再灌注2h后，從假手術組和造模組中各隨機抽取1只，進行TTC染色，觀察梗死灶形成情況，以評價模型復制是否成功。④針刺干預：模型復制成功后，假手術組不做干預。大鼠取穴參考“大鼠穴位圖譜”及“中國獸醫針灸學”確定[9-10]。針刺組大鼠給予百會、四神聰穴針刺干預，間隔8小時一次，至再灌注72h結束；非穴區對照組大鼠分別于百會、四神聰穴區周邊5mm處進行針刺皮膚干預，間隔8小時一次，至再灌注72h結束。

1.3 檢測指標 ①神經功能缺損評分：末次針刺后1h，對各組大鼠進行神經功能缺損評分，評分采用雙盲法，邀請不知情實驗技術人員單獨進行評分，按照各大鼠編號記錄評分。②病理(蘇木素-伊紅染色)：末次針刺后1h，各組隨機抽取2只大鼠，采用過量麻醉法處死，迅速于冰面上取出完整大腦組織，并迅速浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24h以上，常規制備石蠟切片，并行蘇木素-伊紅染色，數碼顯微鏡下觀察病理改變，拍攝照片。③缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量測定：末次針刺后1h，各組剩余大鼠，采用過量麻醉法處死，迅速于冰面上取出完整大腦組織，并用眼科鑷去除缺血區域液化壞死的腦組織，沿缺血灶走行，剝離缺血灶周邊2mm區域內半暗帶組織，置于2ml凍存管中，-80℃保存，用于檢測IL-1、IL-6、TNF-α含量測定。假手術組取相應部位腦組織進行檢測。采用ELISA法檢測各組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量，并進行統計分析。

2 結果

2.1 模型評價

2.1.1 神經功能缺損評分 模型復制后，手術意外及栓塞過重死亡共計4例，假手術組剩余15只，造模組剩余41只，完全清醒后進行神經功能缺損評分，結果顯示：假手術組大鼠神經功能缺損評分均為0分，造模組大鼠2例評分為0分，不符合實驗要求，予以剔除，剩余39只。與假手術組比較，造模組大鼠神經功能缺損評分顯著增高(P<0.01)。見表1。

表1 造模后2組大鼠神經功能缺損評分比較 分，

與假手術組比較，aP<0.01

2.1.2 TTC染色 再灌注后2h，從假手術組和造模組中各隨機抽取1只大鼠，過量麻醉處死取腦，進行TTC染色，結果顯示：假手術組大鼠腦組織呈鮮紅色，未見明顯蒼白區；造模組大鼠右側顳葉區呈蒼白色，為梗死灶所在(見圖1)。

圖1 再灌注后2組大鼠腦組織梗死灶TTC染色

2.2 大鼠一般狀態觀察

2.2.1 生存情況 模型評價后，將模型復制成功的39只大鼠隨機分為2組，非穴區對照組20只、針刺組19只。針刺干預期間，非穴區對照組死亡5只，針刺組死亡3只。假手術組大鼠傷口基本愈合，活動度良好，毛色純白，富有光澤。非穴區對照組大鼠精神狀態較差，毛色枯槁無光澤，活動較少。針刺組大鼠精神狀態尚可，活動范圍較小，但活動度明顯好于非穴區對照組。

2.2.2 神經功能缺損評分 針刺干預后，各組大鼠神經功能缺損評分統計結果顯示：與假手術組比較，非穴區對照組和針刺組大鼠神經功能缺損評分顯著升高(P<0.01)；與非穴區對照組比較，針刺組大鼠神經功能缺損評分顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 干預后3組大鼠神經功能缺損評分比較 分，

與假手術組比較，aP<0.01；與非穴區對照組比較，bP<0.01

2.3 3組大鼠腦組織病理變化 各組大鼠腦組織HE染色結果顯示：假手術組大鼠腦組織未見異常；非穴區對照組大鼠腦組織因液化壞死而出現局部脫片現象(照片中箭頭所示)，高倍鏡下可見大量炎性細胞浸潤(照片中黑色三角所示)，梗死區內可見細胞萎縮壞死，半暗帶組織中可見細胞水腫等改變；針刺組大鼠腦組織梗死灶區域也出現脫片現象，但與非穴區對照組比較，范圍明顯變小，高倍鏡下炎性細胞浸潤程度減輕(見圖2)。

假手術組 非穴區對照組 針刺組

2.4 3組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量比較 檢測結果顯示：與假手術組比較，非穴區對照組和針刺組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.01)；與非穴區對照組比較，針刺組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3 干預后3組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量比較

與假手術組比較，aP<0.01，與非穴區對照組比較，bP<0.01

3 討論

腦梗死因高發病率、高致死率和高致殘率而受到腦血管病研究者們的高度重視。早在1986年，Bederson等[8]就采用線栓法成功復制出與臨床腦梗死疾病高度相似的動物模型。本研究采用的動物模型復制方法為改良線栓法。結果證明，造模組大鼠神經功能缺損評分顯著高于假手術組，并且隨機抽取的大鼠腦組織TTC染色也在造模組大鼠腦切片上檢測到明顯的蒼白區，證實模型復制成功。

本實驗結果驗證了針刺百會、四神聰穴對缺血性腦病的良好療效：與假手術組比較，非穴區對照組和針刺組大鼠神經功能缺損評分及腦組織梗死百分比顯著升高；與非穴區對照組比較，針刺組顯著降低了MCAO模型大鼠神經功能缺損評分及腦組織梗死百分比。病理結果顯示：假手術組大鼠腦組織未見異常；非穴區對照組大鼠腦組織因液化壞死而出現局部脫片現象，高倍鏡下可見大量炎性細胞浸潤，梗死區內可見細胞萎縮壞死，半暗帶組織中可見細胞水腫等改變；針刺組大鼠腦組織梗死灶區域也出現脫片現象，但與非穴區對照組比較，范圍明顯變小，高倍鏡下炎性細胞浸潤程度減輕。結果提示，針刺百會、四神聰穴對MCAO模型大鼠的腦保護作用主要在于能夠減輕梗死區及缺血半暗帶腦組織中的炎癥反應。

免疫細胞的增殖、分化以及生物學作用的發揮受到一系列細胞因子的調節。根據細胞因子結構的同源性可將其分為幾個蛋白質家族：如IL-1家族、IL-6家族、腫瘤壞死因子家族、IL-10家族和造血因子家族等[11]。IL-1是一種致炎細胞因子，廣泛參與了人體組織破壞、水腫形成等多種病理損傷過程。研究表明，IL-1具有明顯的促炎作用，又被稱為前沿性細胞因子。IL-1在腦梗死的發生的早期，發揮著重要的致炎作用[12-13]。IL-6主要由活化的T淋巴細胞和成纖維細胞分泌，其最主要的生物學作用也是促炎作用，此外還具有刺激B淋巴細胞產生抗體等免疫學功能。研究表明，IL-6在腦梗死發生發展過程中也發揮著重要的促炎作用[14]。TNF，主要由活化的巨噬細胞分泌，后續研究發現，TNF-α具有介導炎癥反應和調節細胞增殖分化的功能。近年來的研究表明，在腦梗死的發生早期，也有TNF-α參與其中，主要發揮介導炎癥反應的作用[15]。

本研究結果顯示，非穴區對照組和針刺組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著升高，針刺百會、四神聰穴干預后，含量顯著降低。結果提示，當腦缺血損傷發生時，缺血半暗帶腦組織中迅速發生了炎癥反應，缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量迅速升高。而針刺百會、四神聰穴干預后，IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著降低，說明針刺百會、四神聰穴對IL-1、IL-6、TNF-α的分泌具有一定的抑制作用，從而發揮針刺對MCAO模型大鼠的腦保護作用。

綜上所述，針刺百會、四神聰穴對MCAO模型大鼠具有一定的抗炎作用，該作用可能是通過抑制缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α分泌而實現的，但其抑制IL-1、IL-6、TNF-α分泌的具體機制尚需進一步研究。