L-鳥氨酸發酵液的脫色研究

吳 昊，焦志勇，郝 寧，許 晟

(1.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800； 2.江蘇先進生物與化學制造協同創新中心，江蘇南京210009)

L-鳥氨酸又名α,δ-二氨基戊酸，分子式為C5H12N2O2，它是重要的堿性氨基酸，主要參與鳥氨酸循環(尿素循環)，用于生物體內瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸及多胺的生物合成，對于體內氨態氮的排出有重要作用[1]。L-鳥氨酸及其衍生物具有保肝護肝、健腦、解毒、抑制癌細胞、促進生長和減肥等多重醫學與保健作用[2]，L-鳥氨酸產品在醫藥、保健領域中的應用日益廣泛。目前微生物發酵直接制備L-鳥氨酸已經逐漸成為L-鳥氨酸的主要生產方法[3-4]，但是與傳統的酶水解精氨酸法相比，L-鳥氨酸發酵液中含有大量的色素，高效脫除其中的色素對保證產品質量至關重要。

目前，L-鳥氨酸的提取過程中往往將超濾處理后的發酵液經過離子交換吸附其中的L-鳥氨酸，通過氨水解吸獲得含有L-鳥氨酸的洗脫液，將其濃縮后進行酸化結晶，再對粗晶體溶解后加入粉末活性炭進行脫色，脫色液再次結晶獲得色澤合格的產品[5-6]。在此過程中，由于離子交換樹脂對色素具有明顯的吸附作用，影響了樹脂的分離效率，同時氨水解吸會將吸附的色素與L-鳥氨酸幾乎同時洗脫，增加了后期的純化壓力和分離損失[7]。盡管有文獻報道通過納濾膜分離可將L-鳥氨酸發酵液中的大部分色素攔截[8]，但膜污染也比較嚴重，導致通量迅速衰減，同時納濾膜對L-鳥氨酸也具有一定的攔截損失。

針對以上問題，本文中，筆者以顆粒活性炭為脫色劑，開展L-鳥氨酸發酵液的脫色研究，考察多種因素對脫色效果的影響，在此基礎上建立活性炭動態脫色與再生工藝。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

DSHZ-300A型臺式水浴恒溫振蕩器，江蘇太倉市實驗設備廠；BT01-100M型蠕動泵，保定蘭格恒流泵有限公司；pHS-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠；Ultimate 3000型高效液相色譜儀，美國Dionex公司；紫外-可見光分光光度計，上海棱光技術有限公司；玻璃層析柱，晚晴化玻儀器有限公司。

1.2 原料與試劑

采用精氨酸缺陷型谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum1006(CGMCC No.3663)制備L-鳥氨酸發酵液，發酵液經過離心和超濾處理后為棕黃色透明液體，pH=6.7，其中含L-鳥氨酸34 g/L、L-谷氨酸0.22 g/L、L-丙氨酸0.67 g/L、L-甘氨酸0.79 g/L、葡萄糖0.5 g/L，南京工業大學郝寧課題組提供。

大孔非極性吸附樹脂(HZ-802、HZ830)、大孔弱極性吸附樹脂(HZ-818)、大孔中等極性吸附樹脂(HZ-806)，上海華震科技有限公司；大孔弱極性吸附樹脂AB-8，南開大學化工廠。

顆粒活性炭JL、GH、ZS、ZX-N分別由蘇州佳聯、唐山光華晶科、溧陽竹溪等活性炭生產企業提供(均篩選至0.38～0.54 mm)；H2SO4、NaOH、NaNO3均為分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；L-鳥氨酸標準品，Sigma試劑公司。檢測中所使用的其他試劑均為色譜純或分析純，國藥集團化學試劑有限公司，

1.3 實驗方法

1.3.1 樹脂吸附色素性能考察

將大孔吸附樹脂用2倍體積的無水乙醇浸泡2 h，使其充分溶脹。過濾后，再用3～4倍體積的去離子水浸泡樹脂，并不時攪動，通過多次過濾，將乙醇完全置換出即可使用。將經過超濾處理的L-鳥氨酸發酵液調節至pH 5.0，分別取30 mL，加入3 g吸附樹脂，置于恒溫水浴振蕩器中，以150 r/min振蕩吸附4 h。過濾后，根據樣品檢測結果，計算出大孔吸附樹脂對色素的脫除率及L-鳥氨酸的脫色損失。

1.3.2 活性炭靜態脫色試驗

取經過超濾處理的L-鳥氨酸發酵液100 mL，調節至設定的pH，加入一定量的活性炭(0.38～0.54 mm)，在一定溫度下，置于恒溫水浴振蕩器中，以150 r/min振蕩脫色一定時間，使其對色素的吸附達到平衡。過濾后根據樣品檢測結果，計算出活性炭對色素的吸附容量、脫色率及L-鳥氨酸的脫色損失。

1.3.3 活性炭動態脫色試驗

在玻璃層析柱中填裝16.5 g顆粒活性炭(0.38～0.54 mm)，活性炭床層直徑為1.52 cm，床層高度為27.5 cm，高徑比為18，床層填充體積為50 mL，將其設定為1倍床層體積(1.0 BV)，作為考察動態脫色流出曲線的體積計量單位。將L-鳥氨酸發酵液預熱到70 ℃，按照一定的流速經蠕動泵通入活性炭層析柱，并自上而下流出層析柱，每間隔一定體積，對流出的脫色液進行取樣分析，繪制出流出曲線。

1.3.4 檢測方法

L-鳥氨酸的定量檢測采用異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化法，用高效液相色譜法(HPLC)測定，具體方法見文獻[9]。

料液中的色素含量采用分光光度法檢測，以純水作參比，黃色素在430 nm波長下有較好的吸收峰，故以超濾處理后的發酵液濃縮至1/3體積時的吸光值A430作為基準，設定該基準液的色素含量為ca=1.0 U/mL，在不同稀釋倍數下，根據分光光度計的吸光值表征色素含量的高低，建立色素含量的函數關系，對發酵液中色素的含量進行相對定量測定[10]。根據繪制的色素標準曲線擬合得到回歸方程為c=0.894 17A+0.003 24，R2=0.999 88，線性關系顯著，可用于表征色素含量。

料液的透光率T430，在430 nm下采用分光光度計檢測，以純水為參比，標定為T430=100%。

活性炭比表面積及孔容孔徑的測試，采用BET方程計算比表面積，t值法計算外表面積和孔容積，密度函數理論(DFT)計算樣品的孔徑分布。

活性炭零電荷點pHPZC(水溶液中固體表面凈電荷為零時的pH)的檢測采用質量滴定法[11]。首先將2 g經過去離子水洗至中性并干燥的活性炭加入50 mL的0.05 mol/L NaNO3溶液中(pH為7.0)，用N2吹掃脫除其中的CO2，將瓶口密封后在25 ℃下振蕩48 h后測定其pH作為pHPZC0，隨后將多份50 mL的0.05 mol/L NaNO3溶液均調節至該pH，并分別加入0.05、0.25、0.5、1.0、2.5和5.0 g活性炭，按以上方法振蕩48 h后檢測pH，直至pH不變為止，將該pH作為pHPZC。

1.4 活性炭脫色性能與再生效果的計算

吸附容量的計算見式(1)。

Qi=(ci0V0-ci1V1)/m

(1)

式中：Qi為吸附劑對組分i的吸附容量，ci0、ci1為發酵液和脫色液中組分i的濃度，V0、V1為發酵液和脫色液的體積，m為活性炭的質量。

脫色率(損失率)的計算見式(2)。

脫色率(損失率)=(ci0V0-ci1V1)/(ci0V0)×100%

(2)

活性炭再生率的計算見式(3)。

活性炭再生率=Q1/Q0×100%

(3)

式中：Q1為再生后的活性炭對色素吸附容量，Q0為新活性炭對色素的吸附容量。

2 結果與討論

2.1 吸附樹脂對色素的吸附選擇性及色素性質的確定

取預處理好的樹脂各3.0 g，分別加入30 mL發酵液，在20 ℃、150 r/min的條件下振蕩吸附4 h，考察其對色素的脫除效果，結果見圖1。

圖1 不同樹脂對色素的吸附性能比較Fig.1 Decoloration performance of different resins

由圖1可見，非極性和弱極性吸附樹脂對色素的吸附能力均強于中等極性吸附樹脂HZ-806，這些現象說明L-鳥氨酸發酵液中的大部分色素可能屬于非極性或弱極性分子[12]。由于大孔吸附樹脂在吸附色素時，L-鳥氨酸的脫色損失較大，因此不適合用吸附樹脂進行脫色處理。

2.2 脫色用顆粒活性炭的選擇

向L-鳥氨酸發酵液中分別加入數種顆粒活性炭進行脫色性能的比較，脫色條件為 pH 6.5，活性炭添加量為5 g/L，在60 ℃、150 r/min條件下振蕩脫色40 min，結果見圖2。

圖2 活性炭脫色性能的比較Fig.2 Decolorization performance of different activated carbons

由圖2可見，在pH 6.5下，顆粒活性炭JL與GH的脫色率明顯高于其他顆粒活性炭活性炭。

為了分析相關顆粒活性炭脫色性能差異的原因，對各種顆粒活性炭的物理結構與零電荷點pHPZC進行了檢測，結果見表1。

由表1可知：前3種顆粒活性炭的比表面積均明顯高于脫色性能最弱的顆粒活性炭ZX-N，說明較大的比表面積有利于活性炭吸附色素，但比表面積最大的GH所具有的脫色性能不如JL，可見比表面積并非衡量活性炭脫色潛力的唯一因素。活性炭的脫色性能隨著平均孔徑和活性炭的比孔容的增加而提高。這可能是由于色素分子的吸附存在尺寸排斥效應，活性炭對色素的吸附選擇性會受到孔徑-孔容分布狀況的影響[13]。當活性炭孔徑與被吸附質分子直徑的比值為1.7～3時最有利于吸附[14]，大多數水溶性有機物的直徑為1～3 nm[15]，因此平均孔徑為3.447 nm的JL活性炭吸附色素能力更強，但其脫色損失也最高。由于顆粒活性炭GH的脫色損失率僅為0.78%，故選擇此活性炭進行后續脫色研究。

表1 活性炭的物理結構與零電荷點

2.3 pH對活性炭脫色性能的影響

為了避免酸性料液對管線設備的腐蝕，著重考察活性炭在較高pH下的脫色性能。分別將L-鳥氨酸發酵液調節至pH 6.0～7.0進行脫色，活性炭添加量為5 g/L，在60 ℃、150 r/min條件下，振蕩脫色40 min，結果見圖3。

圖3 pH對活性炭脫色性能的影響Fig.3 Effects of pH on decolorization of activated carbon

由圖3可知：pH為6.0～6.8時，活性炭脫色損失較小，但當pH增至7.0時，L-鳥氨酸回收率明顯下降。顆粒活性炭GH的零電荷點pHPZC為6.83(表1)，而L-鳥氨酸的等電點pI約為9.73，根據文獻[8]報道，在pH 6～6.5的范圍內，絕大部分L-鳥氨酸分子攜帶一個正電荷，此時活性炭表面攜帶正電荷，與其存在一定的靜電排斥，所以脫色損失小，這也是其他零電荷點pHPZC<6.5的顆粒活性炭在此pH下脫色損失大的原因(圖2、表1)。繼續增大pH，活性炭GH表面開始攜帶負電荷，而絕大部分L-鳥氨酸分子依然攜帶正電荷，導致脫色損失加大。pH對脫色效果的影響較為顯著，較低的pH有利于脫色，但當pH>6.8時，脫色率顯著降低，這與前人提出的pH

2.4 溫度和時間對活性炭脫色性能的影響

將L-鳥氨酸發酵液的pH調節為6.5，考察溫度對活性炭脫色性能的影響，結果見表2。

表2 溫度對活性炭脫色性能的影響

由表2可知：較高的脫色溫度有利于減少L-鳥氨酸的脫色損失，同時脫色率隨著溫度的升高而逐漸增大，但當溫度上升到80 ℃后，脫色率不升反降，說明發生了色素解吸。

以此確定脫色溫度為70 ℃。在此溫度下考察脫色時間對脫色性能的影響，結果見圖4。

圖4 脫色時間對活性炭脫色性能的影響Fig.4 Effects of time on decolorization of activated carbon

由圖4可知：在脫色的前30 min，活性炭對色素的吸附迅速提高，至40 min時脫色率已達到77%，并維持了一段時間，說明色素吸附達到平衡；而脫色時間達到60 min后，脫色率略有下降，說明在長期高溫環境中活性炭發生了色素解吸行為。同時，當色素吸附達到平衡，L-鳥氨酸的脫色回收率出現下降，說明顆粒活性炭優先吸附色素，之后才開始吸附L-鳥氨酸。由此可見，脫色時間40 min即可，不宜過長。

2.5 活性炭用量對脫色性能的影響

將L-鳥氨酸發酵液的pH調節為6.5，70 ℃脫色40 min，活性炭用量分別為5.0～15.0 g/L，考察活性炭用量對脫色性能的影響，結果見圖5。

圖5 活性炭用量對脫色性能的影響Fig.5 Effects of activated carbon dosage on the decolorization

由圖5可知：隨著活性炭用量的增加，脫色率提高，當活性炭用量為15.0 g/L時，脫色率已達95%以上，但單位質量活性炭對色素的吸附容量Q僅為14.68 U/g，比活性炭用量為5.0 g/L時下降59%。可見提高活性炭的利用效率需采用動態脫色技術。

2.6 進料流速對活性炭動態脫色性能的影響

L-鳥氨酸發酵液被調節至pH 6.5并預熱至70 ℃，2.5 L發酵液(50 BV)分別以3.0～9.0 BV/h的進料流速上柱進行動態脫色處理，當流出的脫色液中的色素濃度為發酵液中含量的5%時，即可認為發生穿透，其流出曲線見圖6。

圖6 不同進料流速下的色素流出曲線Fig.6 Effluent curves of pigment at various flow rates

由圖6可知：當進料流速從3 BV/h提高至7 BV/h，發生色素穿透的位置逐漸推后，說明活性炭的脫色效果顯著改善，推測在此范圍內液膜擴散為控速步驟，增加進料流速有利于減少活性炭表面液膜層的厚度，使色素被快速吸附。但當進料流速進一步提高至9 BV/h，色素穿透位置提前，表明脫色效果下降，這可能是由于此時發酵液在層析柱內停留時間過短，導致活性炭導致色素未能與活性炭發生充分的吸附作用。其中，進料流速為7 BV/h時的脫色率最高，連續處理45 BV發酵液才出現穿透，此時活性炭對色素吸附容量Q達到50.5 U/g，總脫色率達到98.71%，脫色液的透光率T430達99%，呈無色透明狀。

考察相關進料流速下的L-鳥氨酸流出曲線，結果見圖7。

圖7 不同進料流速下的L-鳥氨酸流出曲線Fig.7 Effluent curves of L-ornithine at various flow rates

由圖7可知：在動態脫色過程中活性炭對L-鳥氨酸的吸附極少，在3～9 BV/h的進料流速下，當流出體積為1.0 BV時均出現L-鳥氨酸完全穿透現象，產品脫色損失均在3%以內，故選擇活性炭層析柱動態脫色的進料流速為7 BV/h。

2.7 活性炭層析柱的解吸與再生

通過顆粒活性炭再生預實驗發現，熱水可將活性炭吸附的少量L-鳥氨酸解吸，但幾乎不能解吸色素，活性炭再生率只有8.5%，而1.0 mol/L的稀H2SO4對活性炭的再生率為74%，1.0 mol/L的NaOH溶液對活性炭的再生率為87%，因此確定采用熱水與NaOH兩步解吸法：第一步采用80 ℃熱水解吸活性炭層析柱中殘留的L-鳥氨酸。結果發現80 ℃熱水可解吸回收丁二酸，在3.0 BV/h的解吸流速下，2.0 BV的熱水可回收70%被活性炭吸附的L-鳥氨酸，使L-鳥氨酸的脫色率達到99%。第二步采用1.0 mol/L NaOH作為再生劑解吸色素，解吸溫度為80 ℃，再生劑用量為5.0 BV，最后用去離子水將殘留的堿液洗出，使流出液的pH降至7.5以下，3種解吸流速下的色素流出曲線見圖8。

圖8 不同解吸流速下的色素流出曲線Fig.8 Desorption curves of pigment at different elution rate

由圖8可知：NaOH的解吸流速為5.0 BV/h時，3.0 BV的再生劑就可以解吸出絕大部分色素。以未使用過的活性炭作為對照，考察相關活性炭的再生效果，結果顯示再生率均在93%以上，其中5.0 BV/h解吸速度下獲得再生活性炭，活性炭再生率達到96.5%。

考察活性炭進行反復脫色及再生性能，結果見表3。

表3 再生次數對活性炭脫色性能的影響

由表3可知：活性炭層析柱再生后重復使用4次，其對同一批發酵液的脫色率均穩定在97%以上，脫色液的透光率T430均達98.5%以上，接近純水的透光率，呈無色透明狀。L-鳥氨酸的損失率均在1%以內，活性炭再生效果穩定。

3 結論

1)L-鳥氨酸發酵液中的大部分色素可能屬于非極性或弱極性分子，具有較高的零電荷點pHPZC、較大的平均孔徑和比孔容積的活性炭GH在pH 6.5下對色素具有較好的吸附能力，而過高的脫色溫度和過長的脫色時間不利于活性炭對色素的吸附。

2)確定了活性炭層析柱對L-鳥氨酸發酵液的動態脫色/再生工藝：進料流速為7.0 BV/h、脫色溫度70 ℃，可連續處理45 BV的發酵液。采用兩步解吸法再生活性炭，第一步采用80 ℃熱水在3.0 BV/h的流速下解吸殘留的L-鳥氨酸，處理量為2.0 BV；第二步在同樣的溫度下采用以1.0 mol/L NaOH以5.0 BV/h流速解吸色素，處理量為5.0 BV。在該條件下，脫色率保持在97%以上，而L-鳥氨酸的損失率低于1%，活性炭重復使用性能穩定。