D-泛解酸內酯水解酶的固定化及酶學性質

王開放，張 梁，辛 瑜，曾 偉，丁重陽，石貴陽

(1.江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫214122； 2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫214122； 3.大連韋德生化科技有限公司，遼寧大連116000)

D-泛解酸內酯被認為是生產D-泛酸的重要中間體，廣泛用作食品和飼料添加劑[1]。D-泛解酸內酯水解酶作為酶源代替昂貴和有毒的化學拆分劑來處理DL-泛解酸內酯，成本較低且對環境無污染[2]，但是游離酶難以回收和重復利用，不利于工業生產的穩定和連續化，對該酶進行固定化研究成為大規模生產研究的熱點[3-4]。例如Sakamoto等[5-6]利用固定化細胞技術對特定菌株進行固定化，選擇性水解DL-泛解酸內酯中的D-構型，將水解產物D-泛解酸分離出來，再經過內酯化轉變成D-泛解酸內酯，此方法已由日本第一制藥(FUJI)公司申請了專利，并投入工業化生產；湯一新等[7-9]利用海藻酸鈉法和戊二醛交聯固定化霉菌法對1株產D-泛解酸內酯水解酶的菌株FusariummoniliformeSW902進行固定化，成功應用于工業化生產；Yu等[10]利用海藻酸鈣對鐮孢霉菌屬的Fusariumsp. BU-011進行固定化；黎明課題組[11-12]對腐皮鐮孢菌酶(Fusariumproliferatumvar.proliferatumAS3.4783)破碎后，用大孔吸附樹脂D380對破碎液進行了固定化研究，固定化酶活達到4 U/g樹脂。然而目前所報道的對D-泛解酸內酯水解酶的固定化研究是以野生菌為出發菌株進行的，野生菌酶產量低，對酶的固定化造成了一定的困難[13]。

本研究中，筆者以前期構建的重組乳酸克魯維酵母(KluyveromyceslactisGG799/pZL505-DL)所產的D-泛解酸內酯水解酶為酶源，進行固定化方面的研究，以期為工業化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-泛解酸內酯水解酶基因來源于串珠鐮孢菌Fusariumverticillioides(GenBank:AY728018.1)，重組乳酸克魯維酵母(KluyveromyceslactisGG799/pZL505-DL)，筆者所在課題組成員前期構建；DL-泛解酸內酯，安徽酷爾生物工程有限公司；D-泛解酸內酯，美國Sigma公司；其他試劑均為市售國產分析純。

高效液相色譜儀(chromaster)，日本日立公司；HYL-C型組合式搖床，太倉市實驗設備廠；DKZ-450B型電熱恒溫振蕩水槽，上海森信試驗儀器有限公司；AL104型分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化載體的篩選

選擇樹脂D301、樹脂D315、樹脂D380、瓊脂糖顆粒和雜化納米花hybrid nanoflowers (hNFs)，對D-泛解酸內酯水解酶的固定化效果進行初篩，確定最佳的固定化載體。

1.2.2 固定化方法的確定

取適量經過處理的樹脂放入50 mL錐形瓶中，每種樹脂每瓶添加1 g，各設3個平行，放入總酶活為12 U的酶液，然后置于搖床中，30 ℃、200 r/min 吸附3 h，在4 ℃預冷，再加入適宜濃度的戊二醛，交聯1 h，最后用去離子水反復沖洗除去游離酶。

瓊脂糖顆粒固定化參照文獻[14]。

hNFs的固定化參照文獻[15]。

1.2.3 酶學性質研究

酶活定義：在一定條件下，每分鐘水解1 μmol D-泛解酸內酯所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

D-泛解酸內酯的HPLC測定方法：將反應后樣品12 000 r/min離心30 min，取200 μL于內襯管中。色譜柱為ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm×3.5 μm，流速0.5 mL/min，紫外檢測波長為215 nm，柱溫25 ℃，流動相組成為V(乙腈)∶V(KH2PO4(0.02 mol/L)=1∶ 19，用稀鹽酸調pH至3.0，進樣量10 μL。

游離酶和固定化酶最適反應溫度的測定：以質量分數4%D-泛解酸內酯水溶液為底物，以pH 7.5的2 mol/L Tris-HCl為緩沖液，將底物和緩沖液在各個溫度條件下預熱5 min后加入適量酶液，反應一定時間后，進行酶活測定，以滅活的酶作為空白對照。

固定化酶和游離酶的溫度耐受性測定：以質量分數4%D-泛解酸內酯水溶液為底物，以pH 7.5的2 mol/L Tris-HCl為緩沖液，取固定化酶和游離酶，并在各個溫度條件下放置30 min， 之后將各個溫度處理過的游離酶和固定化酶取出適量，以未處理的游離酶作為對照，反應一定時間，測定剩余酶活力。

固定化酶和游離酶的最適pH測定：以質量分數 4%D-泛解酸內酯水溶液為底物，取適量酶液，在不同pH條件下反應一定時間后，進行酶活測定。

固定化酶和游離酶的pH耐受性：將固定化酶和游離酶在不同的pH緩沖液保溫1 h后測定其剩余酶活力。

1.2.4 固定化酶填充床反應

為探究固定化酶的高濃度底物水解效果和測定拆分產物的光學純度，自制填充床反應器。拆分產物D-泛解酸內酯的提取方法：將經填充床反應的高濃度底物用相同體積的乙酸乙酯萃取，有機相萃取未參加反應的L-泛解酸內酯和剩余的D-泛解酸內酯，待分層后，有機相用旋轉蒸發儀獲得DL-泛解酸內酯，水相加鹽酸調pH至1.0，靜置12 h，再次用乙酸乙酯萃取，蒸干有機相獲得結晶，即D-泛解酸內酯粗品。取適量結晶，溶于水后用全自動旋光儀測定旋光度。

2 結果與討論

2.1 酶的固定化

2.1.1 固定化載體的確定

利用樹脂D301、樹脂D315、樹脂D380、瓊脂糖顆粒和hNFs進行D-泛解酸內酯水解酶的固定化預試驗，結果如表1所示。

由表1可知：在弱堿性陰離子樹脂中只有D380固定化酶檢測到酶活，推測該樹脂的功能基團和骨架結構有利于該酶的固定化；hNFs法不適用于該酶的固定化；用瓊脂糖顆粒進行酶的固定化，由于其固定化方法的復雜，成本較高，且酶活回收率和比酶活均低于樹脂D380。因此本實驗中,筆者選用D380作為固定化載體，進行固定化研究。

表1 載體對固定化酶活力的影響

2.1.2 固定化加酶量的選擇

取1 g預處理的濕樹脂于50 mL錐形瓶中，放入酶量分別為9、12、15、20、30、50、80、160、200和300 U/g的樹脂，吸附時間為3 h，吸附溫度為30 ℃，吸附酶液的pH為7.0，戊二醛終體積分數為0.2%，交聯時間為1 h,結果如圖1所示。

由圖1可知：隨著酶量的增加，固定化的比酶活逐漸增加。可能由于隨著酶量的增加，酶分子與樹脂功能基團上結合的概率越來越大，到約30 U/g樹脂時，吸附達到飽和，此時固定化比酶活為(8.60±0.16) U/g，高于此加酶量，固定化酶的比酶活增加不明顯，所以選擇的加酶量為30 U/g樹脂。

圖1 加酶量對固定化效果的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on immobilization

2.1.3 固定化pH的選擇

取預處理的濕樹脂于50 mL錐形瓶中，每瓶放入1 g濕樹脂，將酶液的pH分別調為6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，加酶量為30 U/g樹脂，吸附時間為3 h，吸附溫度為30 ℃，戊二醛終體積分數為0.2%，交聯時間為1 h，結果如圖2所示。

由圖2可知：在pH為7.5時，固定化效果最好，所以選擇的固定化pH為7.5，其固定化比酶活為(9.60±0.21) U/g。D380是陰離子交換樹脂，pH只有大于蛋白的等電點，才能更好地發揮與載體之間的吸附交聯作用，但pH過大則會影響酶的催化效果。

圖2 pH對固定化效果的影響Fig.2 Effect of pH on immobilization

2.1.4 固定化吸附時間的選擇

取預處理的濕樹脂于50 mL錐形瓶中，每瓶放入1 g濕樹脂，吸附時間分別設為1、2、3、4、5、7 和9 h，吸附pH為7.5，選擇的加酶量為30 U/g樹脂，吸附溫度為30 ℃，戊二醛終體積分數為0.2%，交聯時間為1 h，結果如圖3所示。

由圖3可知：最佳的吸附時間為5 h，比酶活為(10.9±0.16) U/g；時間超過5 h，固定化效果出現下降的趨勢，推測是由于長時間的振搖導致酶部分失活。

圖3 吸附時間對固定化效果的影響Fig.3 Effect of adsorption time on immobilization

2.1.5 固定化吸附溫度的選擇

取預處理的濕樹脂于50 mL錐形瓶中，每瓶放入1 g濕樹脂，吸附溫度分別為10、15、25、30、35、40和45 ℃，吸附時間為5 h，吸附pH為7.5，選擇的加酶量為30 U/g樹脂，戊二醛終體積分數為0.2%，交聯時間為1 h，結果如圖4所示。

由圖4可知：在10～30 ℃時，隨溫度的升高固定化效果越好，30 ℃固定化酶的比酶活最高，為(11.2±0.14) U/g，可能是由于溫度升高，分子運動加劇，加快了酶分子與載體之間的相互作用；高于此溫度時，固定化效果下降趨勢明顯，推測該酶在較高溫度下酶活力下降較快，因此選擇最佳的吸附溫度為30 ℃。

圖4 吸附溫度對固定化效果的影響Fig.4 Effect of adsorption temperature on immobilization

2.1.6 戊二醛體積分數對固定化效果的影響

取預處理的濕樹脂于50 mL錐形瓶中，每瓶放入1 g濕樹脂，交聯的戊二醛體積分數分別設定為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.3%和0.4%，吸附溫度為30 ℃，吸附時間為5 h，吸附pH為7.5，選擇的加酶量為30 U/g樹脂，交聯時間為1 h，結果如圖5所示。

由圖5可知：戊二醛體積分數高于0.1%時，固定化酶的比酶活變化不大，且比酶活已達到最高，為(11.3±0.32) U/g，戊二醛濃度較低時，只有少量的酶蛋白與載體交聯，且與載體結合不牢固，過高的戊二醛濃度也會使酶失活，所以選擇戊二醛體積分數為0.1%。

圖5 戊二醛體積分數對固定化效果的影響Fig.5 Effect of glutaraldehyde concentration on immobilization

2.1.7 交聯時間對固定化效果的影響

取預處理的濕樹脂于50 mL錐形瓶中，每瓶放入1 g，戊二醛交聯的時間分別設為0.5、1、1.5、2、3和4 h，選擇的戊二醛體積分數為0.1%，吸附溫度為30 ℃，吸附時間為5 h，吸附pH為7.5，選擇的加酶量為30 U/g樹脂，結果如圖6所示。

由圖6可知：交聯時間為1 h時，固定化效果最好，比酶活達到(11.5±0.12) U/g，隨著時間的增加，交聯反應逐漸結束，固定化酶比酶活力不再增加，因此選擇最佳的交聯時間為1 h。

圖6 交聯時間對固定化效果的影響Fig.6 Effect of cross-linking time on immobilization

通過以上方法對重組乳酸克魯維酵母所產D-泛解酸內脂水解進行固定化，得到的固化酶制劑為11.5 U/g，相對黎明等[11]得到的4 U/g的固定化酶，具有一定的優勢。

2.2 酶學性質研究

2.2.1 酶反應的最適溫度

溫度的升高一方面能夠加快反應速度，提高酶活，另一方面會使蛋白變性，導致酶失活。探究不同溫度對固定化酶和游離酶的酶活影響，以最高酶活為100%，測定的溫度分別為20、25、30、37、40、45、50、55、60、65、75和85 ℃，結果如圖7所示。

由圖7可知：溫度在37 ℃時酶活力最高，高于此溫度時，酶失活的速度大于提高酶活的速度，所以選擇游離酶和固定化酶的最適反應溫度為37 ℃。

圖7 溫度對酶活的影響Fig.7 Effects of temperature on enzyme activity

2.2.2 酶的熱穩定性

以未經處理酶的酶活為100%，將純酶分別置于20、25、30、37、40、45、50、55、60、65、75和85 ℃條件下反應30 min，然后測定酶活，結果如圖8所示。

由圖8可知：在50 ℃處理30 min，固定化酶仍保有約最高酶活力的75%，而游離酶只剩余約最高酶活力的45%，固定化酶的熱穩定性高于游離酶，推測是由于固定化載體對酶蛋白具有一定的保護作用。

圖8 溫度對酶穩定性的影響Fig.8 Effects of temperature on enzyme stability

2.2.3 酶反應的最適pH

用不同pH的PBS緩沖液(pH 4.5～7.0)和Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～9.5)配制底物，配制的底物在半小時內進行酶活測定，同時用滅活的酶作為對照，減少自發水解帶來的誤差，結果如圖9所示。

由圖9可知：酸性條件下底物基本未水解，推測原因是底物水解的反饋抑制作用引起的。pH>8時，酶活最高，但此時底物的非特異性水解率較高，得到的D-泛解酸內酯的光學純度相對較低。綜合底物自發水解的情況，選擇酶反應的最佳pH為7.5。

圖9 pH對酶活的影響Fig.9 Effects of pH on enzyme activity

2.2.4 酶pH的穩定性

用不同pH的PBS緩沖液(pH 4.5～7.0)和Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～9.5)稀釋濃縮的酶液，30 ℃放置2 h，然后測定剩余酶活力，以不經過處理的酶的酶活力作為100%，結果如圖10所示。

由圖10可知：固定化酶對低pH的耐受性高于游離酶，可能是由于載體表面的基團對周圍微環境的pH起到一定的緩沖作用。在pH 9.5條件下游離酶和固定化酶的剩余酶活力仍達到75%以上，表明該酶適宜在堿性條件下儲存。

圖10 pH對酶穩定性的影響Fig.10 Effects of pH on enzyme stability

2.2.5 金屬離子對酶反應的影響

金屬離子對固定化酶和游離酶的影響如圖11和12所示。

由圖11和12可知：Ca2+對游離酶和固定化酶的酶活有激活作用，Mn2+和Zn2+對游離酶和固定化酶有明顯的抑制作用，固定化酶對Cu2+、Ni2+和Co2+等離子的耐受性高于游離酶。

圖11 金屬離子對固定化酶酶活的影響Fig.11 Effects of metal ions on immobilized enzyme activity

圖12 金屬離子對游離酶酶活的影響Fig.12 Effects of metal ions on free enzyme activity

2.3 米氏常數的測定

米氏常數Km是酶催化反應的最基本的特征常數，在同一條件下只與酶的性質有關，與酶的濃度無關，Km越大表示酶與底物的親和性越小[16]。

由于游離酶和固定化酶的反應體系和比酶活力不同，為測定方便，以D-泛解酸內酯為反應底物，選擇測定固定化酶動力學參數的反應底物質量濃度為8、10、12、16、20、24、36、50、60和70 g/L，游離酶動力學參數的反應底物質量濃度為10、20、30、40、60、70、80、90和100 g/L，利用雙倒數法測定D-泛解酸內酯水解酶的動力學常數，以底物濃度的倒數S-1為橫坐標，初始反應速率的倒數v-1為縱坐標，繪制的雙倒數圖如圖13所示。經計算得出游離酶Km=170.25 mmol/L，固定化酶Km=207.601 mmol/L，固定化酶對底物的親和力比游離酶對底物的親和力弱，可能是由于固定化酶的空間位阻較大，不利于底物擴散。

圖13 固定化酶和游離酶的動力學曲線Fig.13 Kinetic curves of immobilized and free enzymes

2.4 固定化酶填充床反應

在水解較高濃度底物(25%)時，緩沖液難以有效控制pH的下降，導致水解反應難以繼續進行，為此，筆者設計小型的水解裝置(圖14)，免去了手動每隔10 min添加氨水調pH的操作，也保持了酶水解反應的穩定進行，每隔一定時間取少量反應液測定pH和水解率，并校正氨水流加速率，底物總量為30 mL，氨水總添加量約4 mL，結果見圖15。

由圖15可知：在反應約6 h時，水解率達到27%，水解效率較高,延長反應時間，水解率升高緩慢。經拆分得到的D-泛解酸內酯的光學純度為97.8%，該固定化酶催化效率達到工業化生產的要求。

圖14 固定化酶水解裝置Fig.14 The device of immobilized enzyme hydrolysis

圖15 固定化酶水解的時間曲線Fig.15 Time curve of immobilized enzyme hydrolysis

2.5 固定化酶的操作穩定性

對固定化酶填充床反應器進行操作穩定性實驗，反應底物的質量分數為20%～25%，每批的反應時間為4～6 h，以第1批次的酶活為100%，進行15批次的實驗，結果如圖16所示。

由圖16可知：固定化酶填充床反應器在使用15次之后，酶活降低為原來的70%左右，但增加反應時間，水解率仍能達到30%，與華蕾等[17]得到平均批反應時間7 h、水解率35%～40%的固定化細胞水解效率相當，具有一定的實用價值。

圖16 固定化酶的操作穩定性Fig.16 Operating stability of immobilized enzyme

3 結論

對D-泛解酸內酯水解酶的固定化進行研究，確定使用的固定化載體為大孔吸附樹脂D380，以戊二醛作為交聯劑，對固定化條件進行了優化，較優的結果為：酶的吸附添加量為30 U/g濕樹脂，吸附pH 7.0，吸附溫度30 ℃，吸附時間5 h，戊二醛體積分數0.1%，戊二醛交聯時間1 h，在此固定化條件下得到的固定化酶的比酶活為(11.5±0.12) U/g。研究得到游離酶和固定化酶的最適反應溫度均為37 ℃，在20～40 ℃時有較好的穩定性，最適反應pH均為7.5，反應pH低于7時，固定化酶和游離酶表現為無酶活。游離酶的動力學常數Km為170.25 mmol/L，固定化酶的動力學常數Km為207.60 mmol/L，Ca2+對酶促反應有激活作用，Mn2+對該酶有較強的抑制作用。

后續實驗將進一步探究合適的固定化酶反應器，實現固定化酶對DL-泛解酸內酯催化反應的自動化和連續化操作。