利用農業廢棄物發酵生產D-乳酸

孫家奪，吳 斌，何冰芳

(1. 上海澤潤生物科技有限公司，上海201203；2. 南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800； 3. 南京工業大學藥學院，江蘇南京211800)

D-乳酸是多種手性化合物的合成前體，已廣泛應用于化工、制藥領域[1-2]。近年來發現其在提高聚乳酸材料的熱穩定性、力學強度等方面具有顯著作用，引起許多學者的研究興趣[1,3-4]。

在D-乳酸發酵中，常使用葡萄糖為碳源，這使得發酵的碳源成本居高不下[4-5]。另外，在乳酸菌發酵過中，還需要額外添加某些維生素和氨基酸作為生長因子，酵母膏富含維生素和氨基酸，是常用的氮源，但其價格昂貴，使得氮源成本占到整個乳酸發酵成本的38%左右[6]。因此，尋找廉價物質作為發酵的碳氮源成為降低乳酸發酵成本的必然趨勢[7-9]。玉米芯是玉米加工后剩下的廢棄物，富含木質纖維素，可以水解為葡萄糖和木糖，是發酵工業極有價值的潛在碳源[9-10]。如張杰等[8]以稀硫酸處理的玉米芯水解液為原料，以細菌A-19為生產菌，發酵24 h，產生30.6 g/L的L-乳酸，轉化率82.6%。此外，我國有豐富的棉籽粕、花生粕和菜籽粕等含氮量較高的農業副產品，這些都是潛在的發酵氮源[11-12]。孫駿飛等[13]報道了菊糖芽孢乳桿菌YBS1-5利用麩皮的蛋白酶水解液和纖維素酶水解液替代葡萄糖和酵母粉發酵制備D-乳酸，發酵96 h，D-乳酸產量達99.5 g/L，生產速率達1.04 g/(L·h)，轉化率達89.1%；李媛等[14]通過以花生粕為氮源發酵，最終獲得100 g/L以上的D-乳酸。然而，關于利用農業廢棄物作為D-乳酸發酵的碳和氮源的報道較少。

本研究中，筆者主要嘗試玉米芯酶解液替代葡萄糖，棉籽粕替代酵母膏，結合補料發酵技術生產D-乳酸，以期達到將農業廢棄物資源化利用的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芽孢乳桿菌Sporolactobacillussp. YBS1-5(CCTCC M 2012516)是同型D-乳酸高產菌株[15]，保存于南京工業大學何冰芳教授實驗室。

酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉等，國藥集團化學試劑有限公司；玉米漿，安徽豐原發酵技術工程研究有限公司；玉米芯，江蘇康威生物技術開發有限公司；棉籽粕、菜籽粕、豆粕及玉米胚芽粕，徐州天源糧食加工廠；酸性纖維素酶，寧夏和氏璧生物技術有限公司(酶活力為555 FPU/L)。

1.3.4 玉米芯酶解液的制備

1.2 培養基

固體培養基(1 L)：葡萄糖 20 g、酵母膏 2 g、蛋白胨 2 g、玉米漿 2 mL、KH2PO41 g、乙酸鈉 2 g、MgSO40.2 g；pH 7.0。

種子培養基(1 L)：葡萄糖 20 g、酵母膏 2 g、蛋白胨 2 g、玉米漿5 mL、MgSO40.2 g、麩皮 2 g、CaCO314 g；pH 7.0，接種量10%(體積分數)。

發酵基本培養基(1 L)：玉米漿 15 mL、麩皮 15 g、MgSO40.5 g。

周大國嘆息一聲說：“能確認。唉，毛主任可是我們醫院的骨干，也是咱們江城有特別突出貢獻的中青年專家，真想不到啊，我希望警方能盡早破案，還死者與死者家屬一個公道。”

1.3 實驗方法

用接種環將平板菌轉接入裝液量為 150 mL(500 mL搖瓶)的種子培養基，液體石蠟液封，在37 ℃、150 r/min的條件下，厭氧培養16 h。

將保存于-80 ℃的菌種，接種到固體培養基，在37 ℃厭氧培養箱內活化培養48 h后，再擴大培養，培養條件為37 ℃厭氧培養48 h。

其中，x(t)為液壓介質被壓縮的長度減小量隨時間t變化的函數。由式(2)可以求解出產生半正弦波載荷的脈寬τ和壓力峰值pmax分別為

1.3.2 種子培養

CAP是老年人常見的呼吸系統疾病，由于老年人常合并多種慢性疾病，機體免疫力處于衰退期，因此，發生CAP風險較高[11]。患者發病后，主要表現為咳嗽、咳痰、發熱、呼吸困難等癥狀，嚴重可能引起感染性休克、呼吸衰竭等，具有較高的致死率[12]。機械通氣是改善CAP患者呼吸狀態的常用輔助手段，但由于需要進行插管等侵入性操作，增加了致病菌侵入呼吸道風險，可能引起VAP。據相關數據顯示[13]，機械通氣患者發生VAP比例可高達9%～70%。同時，VAP也是導致CAP患者死亡的主要原因之一。為穩定患者生命體征，改善患者肺功能，降低死亡率，應對患者加強護理干預。

1.3.1 固體培養

1.3.3 發酵培養優化

1)氮源對菌株YBS1-5發酵D-乳酸的影響。以豆粕粉、菜籽粕、棉籽粕、玉米胚芽粕和酵母膏分別作為發酵氮源，考察其對YBS1-5生長，D-乳酸的產量、光學純度和轉化率的影響。添加100 g/L的葡萄糖，并用60 g/L CaCO3做中和劑調節pH，轉速 150 r/min，培養溫度 37 ℃。發酵在搖瓶中進行。

2)棉籽粕用量對菌株YBS1-5發酵產D-乳酸的影響。考察棉籽粕用量對菌株YBS1-5生長，產D-乳酸的產量、光學純度和轉化率的影響。添加100 g/L的葡萄糖，并添加3 U/L中性蛋白酶，用10 mol/L的NaOH來維持發酵液pH為6.5。轉速120 r/min，培養溫度37 ℃。發酵在7 L發酵罐中進行。

姓李的老天爺撒手不管了，這可如何是好？天上的神仙可犯難了，最后大家一商量，到人間再去找一個老天爺。這個老天爺啊，一定要心地善良，做事公道、脾氣又好，才能勝任。

1.4.3 發酵液生物量的測定

中性蛋白酶(EC 3.4.24.28)，諾維信(中國)生物技術有限公司，酶活力為1×104U/L；U-3000型高效液相色譜儀，賽默飛公司；SBA-40C型生物傳感儀及相關標準液和緩沖液，山東省科學院生物研究所；木糖標準品、糠醛標準品和香草醛標準品，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；雷磁PHS-3E型pH計，上海精密科學儀器有限公司；ATN-1100型凱氏定氮儀，上海洪紀儀器設備有限公司；Winpact發酵罐，Major Science公司。

唐詩的模糊美初探 ……………………………………………………………… 王華琴，張青華，張 紅（5．76）

玉米芯的處理方法主要參考Ouyang等[10]報道的方法，并適當修正。具體步驟：①將粉碎的玉米芯用30 g/L H2SO4浸泡2 h，接著125 ℃下蒸汽爆破5 min；②用水進行清洗至中性，過濾，接著將固體殘留物進行酶解。采用酸性纖維素酶進行水解，用量為15 FPU/g干物質；水解條件為在50 ℃、200 r/min條件下反應60 h，固液比1∶ 4(g/mL)。反應結束后，8 000 r/min離心20 min，取上清4 ℃保存備用。

1.3.5 補料發酵

在前期的實驗中發現以100 g/L的還原糖作為補料發酵的初始糖濃度能夠較好地消除底物抑制作用，因而將玉米芯酶解液稀釋到還原糖總質量濃度為100 g/L，作為初始糖濃度進行D-乳酸發酵，發酵中添加3 U/L的中性蛋白酶發酵液和3.5 g/L的棉籽粕，用10 mol/L NaOH維持發酵液pH 6.5進行補料發酵。轉速120 r/min，培養溫度 37 ℃。當葡萄糖質量濃度降到30 g/L時，補加濃縮的玉米芯酶解液，使得發酵液中的初始還原糖糖濃度維持在100 g/L左右。發酵在7 L發酵罐中進行。

1.4 分析方法

1.4.1 總氮量的測定

采用凱氏定氮法進行測定。

參照文獻[15]，吸取一定量的發酵液于試管中，稀釋合適倍數，用752紫外分光光度計于660 nm處測定吸光值，乘以稀釋倍數得到其生物量OD660。

1.4.2 玉米芯酶解液成分的測定

1)葡萄糖和木糖含量測定。參照文獻[15]，采用SBA-40C型生物傳感分析儀進行測定。

2)木糖含量測定。參照文獻[16]，采用HPLC氨基柱法，木糖標準曲線：Y=2.65×峰面積-0.042，R2=0.999。

第四，企業法人。《湖南省關于城中村集體經濟組織產權制度改革的指導意見》規定，只要集體經濟組織愿意申請，根據自己自身的資產狀況，可以申請登記為有限責任公司。這里也是明確可以定位為企業法人。

3)糠醛和5-羥甲基糠醛含量檢測。參照文獻[17]，采用HPLC法測定，5-羥甲基糠醛標準曲線：Y=1.15×峰面積+5.77，R2=0.999 4；糠醛標準曲線：Y=1.29×峰面積+6.48，R2=0.999。

4)酚類含量檢測。參照文獻[18]，以香草醛標定酚類物質的含量，香草醛標準曲線為Y=0.079×OD756-5.978，R2=0.999。

3)水解棉籽粕的中性蛋白酶用量對菌YBS1-5發酵產D-乳酸的影響。考察中性蛋白酶使用量過濾除菌加到培養基中水解棉籽粕對菌YBS1-5發酵產D-乳酸的影響。添加100 g/L的葡萄糖，并添加3.5 g/L的棉籽粕，用10 mol/L NaOH 將發酵液pH 維持在6.5，轉速 120 r/min，培養溫度 37 ℃。發酵在7 L發酵罐中進行。

（1）對PM2.5檢測傳感器進行調試，對其實際響應聲光提示進行記錄，煙霧采集數據、聲光提示記錄如表1所示。

1.4.4 光學純度的鑒定

參照文獻[15]，發酵產物的光學純度采用HPLC進行檢測，標準曲線：Y=0.022 5×峰面積+0.018，R2=0.999，具體計算見式(1)。

綜合型實驗 此類實驗需學生在掌握相關專業基礎實驗操作能力的基礎上，使用多種實驗技術來完成最終實驗[9]。正是因為需要用到多種實驗技術，綜合型實驗對于儀器的開放性及實驗室的開放性要求更高。與基礎驗證型實驗相比，綜合型實驗更能鍛煉學生的協調能力，在專業實驗課中應當占有一定比例。

D-乳酸光學純度=

(1)

1.4.5 乳酸的定量分析

參照文獻[15]，采用高效液相色譜法分析。

有的公司雖然已經認識到大數據對于企業發展的重要性，但是卻因為沒有較強的信息分析技術，導致數據的應用不能充分發揮其實際效用。我國很多企業受傳統思想的禁錮，不能用發展的眼光去看待問題，用陳舊的技術對待新的數據，導致其根本不能最好的發揮價值。長此以往，企業就會失去很多發展機會。

1.4.6 D-乳酸發酵過程中糖酸轉化率的分析

在同型D-乳酸發酵過程中，理論上1分子葡萄糖可以完全轉化為兩分子的D-乳酸，因此發酵過程中的糖酸轉化率具體計算見式(2)。

送走陳主任，呂凌子獨自來到與客廳相連的陽臺上，陽臺上有風，晾衣架上的衣服正在隨風搖擺。呂凌子目光空洞地望著遠方，一只黑色的小鳥從她面前一掠而過。呂凌子并不知道，此時此刻的劉麗芳同樣在陽臺上站著，就在自己腳下。兩位女人各懷心事，都在為同一件事情糾結。

(2)

2 結果與討論

2.1 氮源對菌株YBS1-5發酵產D-乳酸的影響結果

為了尋找可以替代酵母膏的廉價氮源，選擇4種農業廢棄物——豆粕粉、菜籽粕、棉籽粕以及玉米胚芽粕作為氮源。經測定，酵母膏、豆粕粉、菜籽粕、棉籽粕以及玉米胚芽粕的總氮量分別為5.8%、4.5%、6.2%、7.9%和4.2%，按照總用氮量與酵母膏相同的原則，最終它們的所用量分別為6.4、4.7、3.7和6.9 g/L。以60 g/L的CaCO3做中和劑，在搖瓶上考察不同種類氮源對菌株YBS1-5產D-乳酸的影響。其中將采用酵母膏做氮源時發酵所得到的D-乳酸糖酸轉化率視作100%，其他4種氮源發酵產D-乳酸以此作為參考，所得的相對轉化率如圖1所示。由圖1可知：酵母膏、豆粕粉、菜籽粕、棉籽粕和玉米胚芽粕均可以不同程度地被菌株YBS1-5利用，其中，棉籽粕做氮源時D-乳酸的相對轉化率最高(71.3%)，這比豆粕粉、菜籽粕和玉米胚芽粕做氮源時要高，因此，選擇棉籽粕是替代酵母膏的潛在廉價氮源。

蘇楠想去楊小水老家看看，了解一下她的為人。這個想法與李嶠汝一拍即合。出了這事，李嶠汝才發現，她對母親幾乎不了解。農村的母女或父子，大多都這樣，親情多，交流少。彼此的了解，除了衣食住行，所剩無幾。

圖1 氮源對菌株YBS1-5發酵產D-乳酸的影響Fig.1 Effects of different nitrogen sources on fermentation of D-Lactic Acid by YBS1-5

2.2 棉籽粕用量對菌YBS1-5產D-乳酸的影響結果

在添加3 U/L發酵液的中性蛋白酶條件下，用10 mol/L NaOH控制發酵液pH 6.5，考察棉籽粕用量(3.0、3.5、3.7、4.5和6.0 g/L)對菌YBS1-5發酵產D-乳酸的影響，結果見表1。

由表1可以看出，在一定的濃度范圍內，菌YBS1-5產生的D-乳酸濃度隨著棉籽粕用量增加而增加，當添加3.5 g/L的棉籽粕時，以100 g/L的葡萄糖發酵得到D-乳酸72 g/L。因此，添加3.5 g/L的棉籽粕是較為合適用量。

表1 棉籽粕用量對YBS 1-5產D-乳酸的影響

2.3 中性蛋白酶用量對菌株YBS1-5發酵產D-乳酸的影響結果

在添加3.5 g/L的棉籽粕，用10 mol/L NaOH控制pH 6.5條件下，考察添加0、1.5、3.0、4.5、6.0和8.0 U/L的中性蛋白酶對菌株YBS1-5發酵產D-乳酸的影響,結果見圖2。

由圖2可知：在沒有添加中性蛋白酶的情況下，菌株YBS1-5不能有效地利用棉籽粕，100 g/L的葡萄糖僅產生了40 g/L的D-乳酸，轉化率僅為64%。當在發酵液中添加中性蛋白酶液時，菌YBS1-5產D-乳酸的用量也隨著所添加的中性蛋白酶液用量的增加而迅速增加。當中性蛋白酶的添加量為3 U/L時，菌株YBS 1-5產生72 g/L D-乳酸，轉化率為83%，說明棉籽粕水解較充分，氮源釋放較完全，而當添加的中性蛋白酶液超過4.5 U/L時，D-乳酸的產量下降明顯，可能是由于少量中性蛋白酶液殘留所致。同時出于成本考慮，選擇3 U/L的中性蛋白酶作為最適添加量。

圖2 中性蛋白酶用量對菌YBS1-5產D-乳酸的影響Fig.2 Effects of different neutral protease usages on production of D-Lactic acid by YBS1-5

2.4 補料發酵的結果

經檢測，玉米芯酶解液的主要成分：100 g/L葡萄糖、13 g/L木糖、0.97 g/L糠醛、9.4 g/L 5-羥甲基糠醛和0.29 g/L酚類物質。將玉米芯酶解液稀釋到還原糖質量濃度為100 g/L，以此作為發酵初始糖濃度，在添加棉籽粕3.5 g/L，3 U/L的中性蛋白酶，10 mol/L NaOH控制pH 6.5情況下，當葡萄糖質量濃度降到30 g/L左右時，通過補加濃縮的玉米芯水解液使得總還原糖質量濃度為100 g/L左右(共補加含有大概550 g葡萄糖的濃縮液)，結果見圖3。

圖3 菌YBS1-5補料發酵產D-乳酸Fig.3 D-Lactic acid production from strain YBS 1-5 by feed fermentation

由圖3可以看到，菌YBS1-5在90 h內積累了111.8 g/L的D-乳酸，殘留7 g/L的葡萄糖，而由于菊糖芽孢乳桿菌本身缺少利用木糖的關鍵酶基因[19]，所以在整個發酵過程中木糖未被利用。發酵過程中平均生產速率、糖酸轉化率以及光學純度分別為1.24 g/(L·h)、87%和98%以上，光學純度見圖4。

這些數據表明：玉米芯酶解液中殘留的少量糠醛、5-羥甲基糠醛和酚類物質及未脫棉酚的棉籽粕未對菌株YBS1-5產D-乳酸有明顯的抑制作用，菌株YBS1-5能夠有效地利用玉米芯水解液和棉籽粕做底物產D-乳酸。

地面坐標系是以接收機所在位置為坐標原點，正東方向為X軸正方向，Y軸為正北方向，Z軸鉛錘向上三者構成的右手直角坐標系。機體坐標系原點為飛機中心(即雷達觀測目標)，如圖1所示，X軸正方向為平行于飛機機身軸線指向正前方，Z軸位于目標對稱平面內，垂直于X軸指向飛機正上方，Y軸垂直于飛機對稱平面，方向符合右手法則。同時，在飛機直線飛行時，認為飛機速度方向即飛機機體坐標系X軸正方向。被動雷達的雷達視線包括從輻射源到目標和從目標到接收機，在本文中選用的輻射源為導航衛星。考慮到飛機目標在直線飛行時，左右機翼水平，側滾角始終為0°，為了簡化模型，在本文中只考慮方位角和俯仰角。

圖4 D-乳酸的光學純度Fig.4 Optical purity of D-lactic acid

3 結論

本研究采用農業廢棄物玉米芯酶解液和棉籽粕做為D-乳酸發酵的底物。在中性蛋白酶用量為3 U/L發酵液、棉籽粕3.5 g/L、初始還原糖質量濃度為100 g/L的情況下，通過2次補加，菌YBS1-5在90 h內產生了111.8 g/L的D-乳酸，轉化率為87%，光學純度達98%以上。本研究為經濟有效利用農業廢棄物生產D-乳酸提供了一種新的方法。