不同釀酒酵母對駿棗果酒發酵特性的影響

鄒 波，徐玉娟，肖更生，吳繼軍，余元善，唐道邦，溫 靖

(廣東省農業科學院 蠶業與農產品加工研究所/農業部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室， 廣東 廣州 510610)

駿棗(ZizyphusjujubeMill. Cv. Junzao)是鼠李科棗屬植物，廣泛種植于我國新疆地區[1]。研究表明，駿棗具有極高的營養價值，富含碳水化合物、礦物質、維生素、氨基酸、多酚、多糖等營養成分[2-4]，并具有抗氧化、提高免疫力、護肝等功效[5-7]。

據報道，世界上90%的紅棗產于我國，并且產量逐年上升[8]。新疆是我國紅棗的主產區之一，據統計，2015年新疆紅棗種植面積49.6萬公頃，產量305萬噸，位居我國首位[9]。作為新疆主栽品種之一的駿棗，目前主要以鮮食和棗干加工為主，其他形式的加工產品非常少見[8]。研究表明，駿棗的糖含量為60%～80%，加入適當的水分后，非常適合果酒的釀造[10-11]。盡管紅棗發酵酒的研制已有少量報道，但多數棗酒是采用果膠酶解后進行發酵[12]，或者對紅棗進行提汁后發酵[13]。紅棗果膠含量高，酶解過程中易生成甲醇，質量難以控制，與用熱水提取的棗汁發酵酒相比，酶解提汁的發酵酒甲醇含量上升了6倍以上[13]，并且直接采用提取汁液發酵，營養損失較大。

有研究表明，釀酒酵母的種類對果酒的品質有重要的影響。紅棗在釀酒酵母的作用下，一方面產生酒精及多種風味物質，另一方面也可能產生對果酒品質不利的代謝產物，如甲醇、雜醇油等[14-15]。酵母對果酒品質的影響可能與酵母的發酵特性及紅棗的營養成分有關；此外，酵母發酵對紅棗的抗氧化能力等功能也具有一定的影響[6]。目前采用紅棗漿直接進行酵母發酵的研究鮮見報道，本研究以駿棗漿為原料，利用氣相色譜等分析手段，研究在不同商業化釀酒酵母的作用下，酒精度、甲醇、雜醇油、抗氧化能力等指標在發酵過程中的變化規律，以期為駿棗釀酒酵母的篩選提供科學指導和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駿棗，購于新疆喀什；活性干酵母RV002，購自安琪酵母股份有限公司；活性干酵母BO213、FX10，購于法國Laffort公司；活性干酵母EC1118，購于煙臺帝伯仕自釀機有限公司；沒食子酸標準品，購于Sigma-Aldrich公司；正丙醇、異丁醇、異戊醇、4-甲基-2-戊醇(色譜純)標準品，購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)，購自德國Meker公司；總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；水為超純水，其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GC- 2010Plus型氣相色譜儀(配有AOC- 20i自動進樣器和氫火焰離子檢測器(FID))、UV- 1800型分光光度計，日本島津公司；PB- 10型pH計，賽多利斯公司；RFM3400型數顯折光儀，英國Bellingham+Stanley公司。

1.3 實驗方法

1.3.1駿棗果酒發酵工藝流程

駿棗果酒發酵工藝流程見圖1。

駿棗清洗→去核→浸泡→打漿→成分調整→接種→發酵

圖1 駿棗果酒發酵工藝流程

Fig.1 Routing of Jun-jujube wine fermentation

1.3.2發酵操作要點

原料預處理：駿棗洗凈后去核，用80 ℃水(駿棗與水的比例為1∶4)浸泡1 h，然后打漿。

成分調整：駿棗漿中添加白砂糖和檸檬酸，最終總可溶性固形物(total soluble solid，TSS)為23°Brix，總酸為5 g/L，添加亞硫酸鈉50 mg/kg。

接種發酵：酵母活化后加入到棗漿中，活性干酵母的添加量為0.25 g/kg。發酵溫度控制在(25±1) ℃，發酵前3 d每天攪拌3次，3 d后停止攪拌。

1.3.3總可溶性固形物、酒精度、pH值、總酸的測定

分別取發酵0，2，4，7，10 d的樣品，100目濾布過濾后采用數顯折光儀測定TSS含量，pH值用pH計直接測定，總酸(total acids，TA)根據GB/T12456—2008《食品中總酸的測定》中酸堿中和滴定法[16]測定，酒精度的測定根據GB5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》中酒精計法[17]進行。

1.3.4甲醇、雜醇油含量的測定

甲醇、雜醇油含量的測定：準確稱取甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、4-甲基-2-戊醇標品500 mg，用10%乙醇溶液定容到10 mL，該溶液用于定性分析。

混合標準溶液的配制：將甲醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇溶液混合，加入10%乙醇，使各標準品的最終質量濃度為50、125、250、500、1 000 mg/L；取不同質量濃度的混合標準溶液10 mL，加入0.1 mL 4-甲基-2-戊醇溶液(內標)。

樣品的制備：棗酒在10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液10 mL，加入內標4-甲基-2-戊醇溶液0.1 mL，采用0.22 μm濾膜過濾后進行氣相色譜分析。

氣相色譜條件：色譜柱為DB- FFAP聚乙二醇強極性柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫模式為起始溫度40 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升溫至50 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升溫至120 ℃，保持1 min，再以20 ℃/min升溫至240 ℃，保持3 min；檢測器溫度為250 ℃；進樣口溫度為250 ℃；載氣(N2)流速1.0 mL/min；進樣量1.0 μL；分流比為20∶1。

定量分析采用內標加入法，以4-甲基-2-戊醇為內標，以甲醇和各雜醇油峰面積與內標的比值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。樣品中的甲醇和雜醇油的含量根據標準曲線計算。

1.3.5總酚含量的測定

樣品用5倍體積的HCl-甲醇(體積比為1∶99)超聲提取10 min，然后10 000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀重復提取1次，合并提取液。總酚含量采用Folin-Ciocalteu法[18]進行測定，以沒食子酸為標準對照品，繪制標準曲線，駿棗酒中總酚含量以沒食子酸當量(gallic acid equivalent，GAE)表示。

1.3.6總抗氧化能力的測定

總抗氧化能力按照總抗氧化能力(T- AOC)測定試劑盒的方法進行。在37 ℃時，將單位時間(min)、單位體積(mL)樣品使反應體系的吸光值每增加0.01個總抗氧化能力單位，作為樣品的總抗氧化能力，以U/mL表示。

1.4 數據處理

實驗均設置3次平行，數據以均值±標準差表示，采用Origin 8.05軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 不同酵母對駿棗果酒發酵過程中TSS、酒精度、pH值和TA的影響

駿棗果酒發酵過程中TSS、酒精度、pH值和TA的變化結果如圖2。圖2(a)、(b)中，發酵前4 d，4種酵母均快速消耗碳水化合物，導致TSS快速下降，其中EC1118和RV002組前4 d的TSS下降速度明顯快于BO213和FX10組；發酵第4天至第10天，EC1118和RV002組的TSS無明顯變化，而BO213和FX10組呈現緩慢下降趨勢。與之對應的，發酵前4 d，EC1118和RV002組酒精度快速上升，分別從0增加至9.30%和9.6%，10 d后酒精度分別為11.68%和11.89%；而BO213和FX10組發酵8 d后酒精度增速變緩，10 d后酒精度不再上升，最終酒精度分別穩定在11.05%和10.84%，因此后續的理化指標檢測取樣從0 d到10 d。

圖2(c)和(d)中，pH值略微下降，TA輕微上升，整體變化不明顯。這說明不同種類的釀酒酵母對駿棗果酒的酸度影響不大。

圖2 駿棗果酒發酵過程中TSS含量、酒精度、pH值、TA的變化Fig.2 Changes in TSS, alcohol content, pH, and TA of Jun-jujube wine during fermentation

2.2 不同酵母對駿棗果酒發酵過程中甲醇和雜醇油的影響

甲醇是果酒中對人體有害的微量成分。甲醇對視覺神經和中樞神經系統具有破壞作用，可導致頭暈、失明，甚至死亡[19]。雜醇油是一類碳原子數超過2的醇類化合物，主要包括正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等，也叫高級醇[20]。研究表明，雜醇油較難被人體代謝，在機體內停留時間較長，是導致飲酒上頭的主要物質[14,20]。駿棗酒中甲醇和雜醇油的氣相色譜如圖3。從圖中可以看出，駿棗酒中含有甲醇、正丙醇、異丁醇和異戊醇。

1.甲醇； 2.乙醇； 3.正丙醇； 4.異丁醇； 5.4-甲基-2-戊醇(內標)； 6.異戊醇。圖3 FX10發酵的駿棗果酒甲醇和雜醇油的氣相色譜Fig.3 Gas chromatogram of methanol and fusel oil of Jun-jujube wine fermented by FX10

駿棗果酒發酵過程中甲醇的變化如圖4。發酵2 d后，甲醇濃度從高到低依次為RV002、EC1118、FX10和BO213；發酵2～10 d，FX10甲醇含量沒有明顯變化，其他3組均有所下降；發酵結束后，以BO213甲醇含量最低，質量濃度為7.52 mg/L。本研究與張麗芝[12]、張寶善等[13]的研究有所不同，這可能與原料的前處理工藝不同有關，前者采用的是酶解后的棗汁進行發酵，后者采用的是熱水浸提的紅棗提取液進行發酵，本研究采用的是紅棗原漿直接進行發酵。紅棗酒中甲醇的來源主要有兩種：一種是果膠水解后產生，這也是最主要的來源；另一種是甘氨酸脫氨基和羧基降解后形成[19]。由于駿棗含有大量的果膠成分，因此控制棗酒中甲醇的含量尤為重要。不同的釀酒酵母對果膠及甘氨酸的分解能力有所差異，本研究結果表明，酒精發酵速度快時，棗酒中甲醇含量相對也高一些，這與前人報道的結果一致[12]。

圖5 駿棗果酒發酵過程中雜醇油含量的變化Fig.5 Changes in fusel oil contents of Jun-jujube wine during fermentation

圖4 駿棗果酒發酵過程中甲醇含量的變化Fig.4 Changes in methanol contents of Jun-jujube wine during fermentation

駿棗果酒發酵過程中雜醇油含量的變化情況如圖5。圖5(a)中，發酵過程中正丙醇濃度均呈先增加后降低的趨勢，發酵結束后，以EC1118組正丙醇濃度最高，其次是RV002組，兩者的正丙醇質量濃度均超過200 mg/L；相對而言，BO213組和FX10組正丙醇質量濃度較低，分別為53.57 mg/L和90.30 mg/L。圖5(b)中，FX10組異丁醇的變化最大，發酵前7 d快速上升，10 d后升至60.10 mg/L，其他3組變化較小，其中以BO213組變化最小，發酵10 d后異丁醇的質量濃度為12.70 mg/L。圖5(c)中，發酵過程中異戊醇的變化與異丁醇的變化趨勢類似，發酵10 d后，FX10組異戊醇質量濃度最高，為950.00 mg/L；BO213組質量濃度最低，為202.33 mg/L。圖5(d)中，隨著發酵時間的延長，雜醇油呈現先上升后下降的趨勢，發酵10 d后，雜醇油的質量濃度從高到低依次為FX10、EC1118、RV002、BO213(268.6 mg/L)。

雜醇油是酵母果酒發酵過程中的副產物，主要來源于氨基酸代謝和糖代謝[14]。眾多研究表明，酵母的種類對雜醇油的生成影響較大[10,15,21]。王宓等[21]研究了6種酵母對紅棗白蘭地原料酒雜醇油的影響，發現不同酵母菌發酵的紅棗白蘭地，雜醇油的含量存在明顯差異，以安琪耐高溫釀酒高活性干酵母產生的雜醇油含量最低。張麗芝[12]研究了3種酵母對發酵棗酒中雜醇油的影響，結果表明，采用實驗室分離的葡萄酒酵母菌發酵的紅棗酒，雜醇油含量最低。Aragon等[22]的研究也表明，酵母的種類對雜醇油的生成影響較大。

2.3 不同酵母對駿棗果酒發酵過程中總酚和抗氧化能力的影響

駿棗果酒發酵過程中總酚的變化如圖6。整個發酵過程中，總酚含量沒有明顯的變化，不同組別之間差異不大。發酵10 d后總酚質量濃度為1.50～1.56 g/L。駿棗果酒發酵過程中總抗氧化能力的變化如圖7，隨著發酵時間的延長，各組發酵的總抗氧化能力逐漸上升，發酵10 d后，BO213組和FX10組總抗氧化能力明顯高于EC1118組和RV002組。發酵期間，抗氧化能力與總酚沒有明顯的相關性，說明酵母的生長代謝活動對駿棗果酒的抗氧化能力有較大影響。

圖6 駿棗果酒發酵過程中總酚質量濃度的變化Fig.6 Changes in total phenolic contents of Jun-jujube wine during fermentation

圖7 駿棗果酒發酵過程中總抗氧化能力的變化Fig.7 Changes in total antioxidant capacities of Jun-jujube wine during fermentation

研究表明，酵母發酵可影響水果的抗氧化能力[6]。酵母可以促進植物細胞內溶物的釋放，并將黃酮類化合物降解成抗氧化能力更強的酚酸類物質。Wang等[23]研究了桑果發酵過程中抗氧化能力的變化，結果發現，不同品種的桑果在酵母發酵過程中，DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力均上升；鄭嬌等[15]和Zou等[24]也有類似的報道。此外，酵母的種類對抗氧化能力也有較大影響，不同的釀酒酵母，其發酵果酒的抗氧化能力也不盡相同。研究表明，采用3種酵母菌(BV818、ICV254 和CY3079)制備的海紅果酒，其清除DPPH自由基能力和還原能力各不相同[15]，本研究結果與之相似。

3 結 論

對4種釀酒酵母發酵的駿棗果酒進行了各項理化指標和總抗氧化能力的研究，結果表明，發酵期間TSS、酒精度變化明顯，其中以EC1118和RV002酵母酒精發酵速度較快，BO213和FX10發酵速度較慢。氣相色譜分析結果表明，RV002發酵的棗酒甲醇含量高，FX10發酵的棗酒雜醇油含量高，而BO213發酵的棗酒甲醇和雜醇油含量均較低。隨著發酵的進行，各種釀酒酵母均能增加棗酒的抗氧化能力，以BO213發酵的棗酒總抗氧化能力最高。本研究結果說明，釀酒酵母BO213產酒能力較好，產甲醇和雜醇油的能力低，抗氧化能力高，是這4種酵母菌中最適合駿棗果酒發酵的菌種。

駿棗果酒發酵結束后還需要進行澄清處理，因棗漿黏度較高，后續可進一步研究駿棗果酒的澄清工藝和穩定性，以期為駿棗果酒的開發提供更為充分的參考依據。