不同單色光對紫色紅曲霉生長、色素和桔霉素合成的影響

劉 宏，陳 迪，2，陳勉華，李貞景，王昌祿,*

(1.天津科技大學 食品工程與生物技術學院/省部共建食品營養與安全國家重點實驗室/食品營養與安全教育部重點實驗室， 天津 300457；2.河南工業大學 生物工程學院， 河南 鄭州 450001)

紅曲霉可以產生大量具有生物活性物質的次級代謝產物[1-3]。紅曲色素作為紅曲霉的主要次級代謝產物，具有多種生物活性[4-12]。人們已完成了6種主要紅曲色素的結構鑒定，包括兩種紅色素：紅斑紅曲胺(rubropunctamine，RUM)、紅曲玉紅胺(monascorubramine，MOM)；兩種黃色素：紅曲素(monascin，MS)、紅曲黃素(ankaflavin，AK)；兩種橙色素：紅斑紅曲素(rubropunctatin，RUN)、紅曲玉紅素(monascorubrin，MON)[3]。真菌腎臟毒素——桔霉素的發現引起了人們對于紅曲霉安全性的爭論，限制了紅曲產品的開發和應用[13]；因此，在提高紅曲色素產量的同時降低桔霉素產量，對紅曲產品開發和應用具有重要意義。

光作為一種重要信號，可用來調控絲狀真菌的生長、發育及次生代謝。不同波長的單色光對絲狀真菌的生長發育及次級代謝的影響各不相同[14]。大量研究[15-18]表明，不同光源對紅曲霉色素和桔霉素的產生有很大影響，但研究還不夠深入。目前，系統研究不同光源對紅曲霉生長及色素產生的報道并不多見，研究紅光不同光照條件對紅曲色素和桔霉素產生的影響也鮮有報道。本文擬對不同波長單色光特別是紅光對紫色紅曲霉(Monascuspurpureus)M9生長、色素和桔霉素產量的影響進行研究，并從分子水平上初步探討光照培養對紅曲色素和桔霉素代謝機理的影響，希望為光照發酵法高產紅曲色素、低產桔霉素提供技術支撐，為紅曲霉次生代謝途徑研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌種來源

紅曲霉菌株(MonascuspurpureusM9)，由天津科技大學食品工程與生物技術學院發酵食品與生物資源開發研究室保藏。

1.1.2主要試劑

葡萄糖、蛋白胨、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4，天津市化學試劑一廠；無水乙醇，天津市江天化工技術有限公司；瓊脂粉，北京索萊寶生物科技公司，以上試劑均為國產分析純。乙腈、甲酸(國產色譜純試劑)，上海安譜科學儀器有限公司；GoldviewI型核酸染色劑、6×DNA Loading Buffer、1kb plus DNA Ladder(國產生化試劑)，北京索萊寶生物科技公司；DM2000 Marker(國產生化試劑)，康維世紀生物科技有限公司；Plant RNA Kit，美國Omega Bio-Tek公司；HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，康維世紀生物科技有限公司；SYBR? Premix Ex TaqTM II，Takara(大連)有限公司。

1.1.3主要培養基

麥芽汁瓊脂培養基(MEA)：將麥芽磨碎，加入4倍體積水，60 ℃水浴至麥芽糖度為18～20°BX，8層紗布過濾，置于-20 ℃冰箱備用。使用時融化麥芽汁，將糖度調為10～12°BX，加入質量分數為3%瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

種子液培養基：葡萄糖6 g，蛋白胨 2 g，NaNO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，自來水100 mL，乳酸調pH值至5.5左右，121 ℃滅菌20 min。

液體發酵培養基：大米粉5 g，NaNO30.3 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KH2PO40.15 g，自來水100 mL，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

固體平板培養基：麥芽糖4 g，可溶性淀粉5 g，蛋白胨 3 g，瓊脂3 g，自來水100 mL，pH值自然，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD型超凈工作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海華線醫用核子儀器有限公司；LRH-250-GII型微電腦控制光照培養箱，廣東省醫療器械廠；J-26XP型高速冷凍離心機，貝克曼庫爾特(中國)有限公司；1200型高效液相色譜儀、MX3000P型實時熒光定量PCR儀，美國安捷倫科技有限公司；KW-T8ZW-12W型LED單色燈(紅光、黃光、綠光和藍光)，深圳宸華照明有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1菌株保藏和種子液制備

用無菌接種環挑取紫色紅曲霉M9菌絲，劃線于麥芽汁斜面培養基上，30 ℃培養7～9 d，將活化好的菌種保藏于4 ℃冰箱，一個月活化一次。

向紫色紅曲霉M9試管斜面加入5 mL生理鹽水，用無菌孢子鏟輕輕刮取孢子，制成孢子懸液。將孢子懸液全部倒入種子培養基中，在30 ℃，180 r/min的搖床中培養36～40 h，制成種子液。

1.3.2菌落形態觀察

將制備好的種子液過8層無菌紗布，得到孢子懸液，通過血球計數板將孢子濃度調為106個/mL。取20 μL孢子懸液，單點法加在固體平板培養基中心，待菌液被培養基充分吸收后轉入裝有LED單色燈(紅光、黃光、綠光和藍光)的恒溫培養箱中。調整光照強度為100 lx，光照組置于光源的正下方，黑暗組避光培養，30 ℃靜置培養10 d，分別在第4、7、10天記錄菌落形態。

1.3.3液態發酵方法和光照條件

將制備好的種子液過8層無菌紗布，得到孢子懸液，調孢子濃度為106個/mL。將5 mL孢子懸液接種于50 mL的大米液態發酵培養基中，置于30 ℃恒溫培養箱中，靜置培養10 d。

光照實驗分為兩組。第一組將恒溫培養箱劃分為5個獨立燈室，每個燈室安裝不同波長的LED單色光(紅光、黃光、綠光和藍光)。光照強度調整為100 lx，光照時間為持續光照，避光室為黑暗培養。第二組將恒溫培養箱劃分為5個獨立燈室，每個燈室安裝紅色LED單色光，分別在不同光照時間15、30、45、60 min/d，不同光照強度100、200、300、400 lx下培養，避光室為黑暗培養。

1.3.4紅曲色素和桔霉素的提取方法

將發酵結束后的紅曲霉菌絲體烘干至恒重，用研缽將其磨成粉末狀，過80目篩。準確稱取0.500 0 g紅曲粉末樣品，裝入10 mL離心管中，加入4 mL 75%乙醇，振蕩混勻，超聲30 min，3 500 r/min離心10 min，收集上清液于10 mL容量瓶中。向沉淀物中加入3 mL 75%乙醇，混勻，超聲30 min，3 500 r/min離心10 min，收集上清液。再重復此操作一次，將3次上清液合并，用75%乙醇定容至10 mL。稀釋10倍后，用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾，高效液相色譜(HPLC)法進行分析。

1.3.5紅曲色素和桔霉素的HPLC檢測

1.3.5.1 紅曲色素的測定

色譜柱：XDB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流動相：A泵(水+0.1%甲酸)，B泵(乙腈)。乙腈和水分別過0.45 μm的有機系濾膜和水系濾膜，脫氣30 min。檢測器：DAD(二極管陣列檢測器)，流速為1 mL/min，檢測波長為410 nm，檢測溫度為25 ℃，進樣量為20 μL。

梯度洗脫方法如表1。

表1 HPLC梯度洗脫流動相比例

1.3.5.2 桔霉素的測定

色譜柱：XDB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)；流動相：A泵(水，色譜純甲酸調pH值為2.5)，B泵(乙腈)。乙腈和水分別過0.45 μm的有機系濾膜和水系濾膜，脫氣30 min。檢測器為熒光檢測器，流速為1 mL/min，檢測波長為激發波長(λex)331 nm，發射波長(λem)500 nm，檢測溫度為25 ℃，進樣量為20 μL。桔霉素檢測采用等度洗脫，流動相中水與乙腈的比例為55%：45%。

1.3.6紅曲色素和桔霉素合成相關基因表達量的測定方法

以NCBI(National Center for Biotechnology Information)報道的紅曲霉色素和桔霉素合成相關基因序列為參考序列。與紅曲霉色素合成相關的基因有MpPKS5、mppR1、mppA、mppB、mppC、mppD、mppE、mppR2、MpFasA2、MpFasB2、mppF(Gen Bank accession no. KC148521)，與紅曲霉桔霉素合成相關的基因有orf1、ctnA、orf3、orf4、orf5 (Gen Bank accession no. AB243687)、pksCT(Gen Bank accession no. AB167465)、ctnD、ctnE、ctnF、ctnG、ctnH、ctnI、ctnR(Gen Bank accession no. EU309474)。用NCBI上的Primer-BLAST軟件設計引物，以β-actin基因作為內參基因。

使用Omega廠家生產的Plant RNA Kit提取紅曲霉總RNA，用HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄為cDNA，采用SYBR Green染色實時熒光定量PCR方法對紅曲色素與桔霉素合成相關基因相對表達量進行監控。擴增曲線條件：95 ℃，30 s，1 Cycle；95 ℃，變性5 s，60 ℃，退火30 s，72 ℃，延伸30 s，42 Cycles。溶解曲線條件：95 ℃，15 s，60 ℃，退火30 s，最后，產物在95 ℃延伸15 s，同時在60～95 ℃進行溶解曲線分析。采用β-actin基因作為內參基因。

1.3.7數據統計分析

使用SPSS17.0軟件，對實驗數據進行方差分析；用Origin9.0軟件繪圖。每個實驗做3個平行實驗，結果以平均值±標準差表示。P<0.05(*)，P<0.01(**)。

2 結果與討論

2.1 不同單色光對紫色紅曲霉M9菌落形態的影響

A：持續黑暗；B：持續紅光；C：持續黃光；D：持續綠光；E：持續藍光。從左往右依次為培養第4、7、10天。圖1 持續光照對紫色紅曲霉M9菌落形態的影響Fig.1 Effects of continuous light exposure on colony morphology of Monascus purpureus M9

以黑暗培養條件作為對照，研究不同單色光在持續光照下對紫色紅曲霉M9菌落形態的影響，結果如圖1。由圖1可知，相比黑暗條件下，當在持續紅光照射時，第4天時出現很明顯的輻射狀褶皺；隨著培養時間的增加，輻射狀褶皺逐漸增多，在第10天時出現顯著的暗紅色區域，菌絲更長、更稠密且顏色更深。在持續藍光照射下，菌絲顏色為白色，極為稀疏，無輻射狀褶皺出現。在持續黃光和綠光照射下，菌絲顏色稍淺且無明顯輻射狀褶皺和暗紅色區域出現。結合前期研究成果[19]及本研究可以看出：相比黑暗條件，在持續光照下，紅光可以顯著促進紫色紅曲霉M9菌絲生長及菌絲內色素的合成；藍光顯著抑制了菌絲的生長及菌絲內色素的合成；黃光和綠光對菌絲生長及菌絲內色素的產生有些抑制作用。

2.2 不同單色光對紫色紅曲霉M9紅曲色素產量的影響

*，P<0.05; **,P<0.01。圖2 持續光照對紫色紅曲霉M9 6種紅曲色素產量的影響Fig.2 Effects of continuous light exposure on six monascus pigments production of Monascus purpureus M9

以黑暗培養條件作為對照，研究不同單色光在持續光照下對紫色紅曲霉M9產生6種色素產量的影響，結果如圖2。由圖2可以看出，相比黑暗條件，在持續紅光照射時，6種紅曲色素產量都有增加，兩種紅色素RUM、MOM的產量分別增加了7.86%、17.33%；兩種黃色素MS、AK產量分別增加了11.14%、15.61%；兩種橙色素RUN、MON的產量分別增加了11.47%、16.69%。在持續黃光照射時，6種色素的產量分別降低了8.28%、24.46%、9.64%、6.57%、10.21%、15.6%；在持續綠光照射時，6種色素產量分別降低了8.41%、30.62%、11.43%、8.34%、33.56%、57.71%；而在持續藍光照射時，6種色素產量降低得更為顯著，分別降低了47.43%、36.75%、48.22%、52.31%、73.84%、60.71%。由此可知，持續紅光照射增加了紫色紅曲霉M9 6種色素的產量，而持續黃光、綠光、藍光照射都減少了紫色紅曲霉M9 6種色素的產量。

不同單色光對紫色紅曲霉M9菌落形態及色素產量影響結果表明，紅光是最顯著促進紅曲霉生長以及色素產生的光源。據文獻報道，不同光照時間和光照強度是影響紅曲色素產生的主要因素[11]，因此，后續實驗中，主要研究不同紅光照射條件對紅曲色素和桔霉素產量及相關基因表達量的影響。

2.3 紅光不同光照時間對紫色紅曲霉M9色素及桔霉素產量的影響

圖3 紅光不同光照時間對紫色紅曲霉M9色素和桔霉素產量的影響Fig.3 Effects of red light with various illumination time on monascus pigments and citrinin production of Monascus purpureus M9

以黑暗培養條件作為對照，研究紅光不同光照時間對紫色紅曲霉M9色素及桔霉素產量的影響，結果如圖3。由圖3可知，隨著紅光光照時間的增加，兩種紅色素RUM、MOM和兩種黃色素MS、AK產量都呈現先增加后減少的趨勢，而兩種橙色素RUN、MON產量呈現先減少后增加的趨勢；桔霉素產量的變化趨勢與橙色素相似。相比黑暗條件下，在紅光不同光照時間下，兩種紅色素和兩種黃色素的產量都有顯著增加，而兩種橙色素及桔霉素的產量卻顯著降低。由此分析可知，相比黑暗條件，紅光不同光照時間可以促進RUM和MOM以及MS和AK的產生而抑制RUN和MON的產生，同時也抑制了桔霉素的產生。當紅光光照時間為30 min/d時，RUM和MOM產量分別增加了36.01% 和 55.72%，MS 和 AK產量分別增加了29.67% 和 37.92%，RUN和MON產量分別降低了27.83% 和 29.42%；桔霉素產量降低了25.39%。本研究表明，紅光照射30 min/d為最佳的高產紅曲色素低產桔霉素的光照時間。

2.4 紅光不同光照強度對紫色紅曲霉M9色素及桔霉素產量的影響

圖4 紅光不同光照強度對紫色紅曲霉M9色素和桔霉素產量的影響Fig.4 Effects of red light with various illumination intensities on monascus pigments and citrinin production of Monascus purpureus M9

*，P<0.05; **,P<0.01。圖5 紅光不同光照條件對紫色紅曲霉M9紅曲色素和桔霉素合成相關基因表達量的影響Fig.5 Effects of red light with different illumination conditions on expressions of monascus pigments and citrinin biosynthetic genes of Monascus purpureus M9

以黑暗培養條件作為對照，研究紅光不同光照強度對紫色紅曲霉M9色素及桔霉素產量的影響，結果如圖4。由圖4可知，隨著紅光光照強度的增加，兩種紅色素RUM、MOM和兩種黃色素MS、AK的產量都呈現先增加后減少的趨勢，而兩種橙色素RUN、MON產量呈現先減少后增加的趨勢；桔霉素產量的變化趨勢與橙色素相似。相比黑暗條件下，在紅光不同光照強度下，兩種紅色素和兩種黃色素的產量都顯著增加，而兩種橙色素和桔霉素的產量顯著降低。由此分析可知，相比黑暗條件下，紅光不同的光照強度可促進RUM和MOM及MS和AK的產生，抑制RUN和MON的產生，對桔霉素的產生也有抑制作用。當紅光光照強度為300 lx時，RUM和MOM產量分別增加了54.32%和71.51%，MS和AK產量分別增加了42.28%和59.72%，RUN和MON產量分別降低了41.94%和54.63%；桔霉素產量降低了40.19%。本研究表明，紅光300 lx光照強度為最佳的高產紅曲色素低產桔霉素的光照強度。

2.5 紅光不同光照條件對紅曲色素和桔霉素合成相關基因表達量的影響

以黑暗培養條件作為對照，研究紅光不同光照條件對紅曲色素和桔霉素合成相關基因表達量的影響，結果如圖5。由圖5(a1)、(a2)和(b1)、(b2)可知，在紅光不同光照時間下，紅曲色素合成相關基因mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2的基因表達量由高到低依次為黑暗，15、60、45、30 min/d，而mppC、mppE的基因表達量由高到低依次為30、45、60、15 min/d，黑暗；在紅光不同光照強度下，紅曲色素合成相關基因mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2的基因表達量由高到低依次為黑暗，100、200、400、300 lx，而mppC、mppE的基因表達量由高到低依次為300、400、200、100 lx，黑暗。結合圖3和圖4，紅光不同光照時間和強度對紅曲色素產量的影響可推測，mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2的基因表達量變化趨勢與紅曲色素中兩種橙色素產量的變化趨勢呈正相關，mppC、mppE的基因表達量變化趨勢與紅曲色素中兩種紅色素和兩種黃色素產量的變化趨勢呈正相關。由此分析可初步推測，在紅光照射條件下，mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2可能參與了橙色素的生物合成，而mppC、mppE可能參與了紅色素和黃色素的生物合成。

由圖5(c1)、(c2)和(d1)、(d2)，結合圖3和圖4，同理可推測出，桔霉素合成相關基因ctnA/D/E/F/G/H/I、orf1/3/4/5、pksCT的基因表達量與桔霉素的產量呈正相關，而ctnR1的基因表達量與桔霉素的產量呈負相關。通過分析結果可初步推測，在紅光照射條件下，ctnA/D/E/F/G/H/I、orf1/3/4/5、pksCT可能參與了桔霉素的合成代謝，而ctnR1可能參與了桔霉素的分解代謝。

3 結 論

通過研究不同單色光對紫色紅曲霉M9菌落形態和6種紅曲色素產量的影響及紅光不同照射條件對6種紅曲色素和桔霉素產量及相關基因表達量的影響，可得出結論：1)相比黑暗條件，在持續光照下，紅光是最顯著的促進紫色紅曲霉M9菌絲生長及色素產生的光源。2)高產紅曲色素低產桔霉素的最佳紅光光照時間為30 min/d，最佳光照強度為300 lx。3)初步推測紅曲霉M9色素合成相關基因mppA/B/D/F、mppR1/R2、MpPKS5、MpFasA2/B2可能參與兩種橙色素的生物合成，而mppC、mppE可能參與兩種紅色素和兩種黃色素的生物合成；ctnA/D/E/F/G/H/I、orf1/3/4/5、pksCT可能參與桔霉素的合成代謝，而ctnR1可能參與桔霉素的分解代謝。

今后，可深入研究紅光調控紫色紅曲霉M9產生紅曲色素和桔霉素機理，為光照發酵法提高紅曲色素產量、降低桔霉素生成機制提供依據，為進一步研究光照調控其他絲狀真菌的次級代謝提供參考。