納米球形聚電解質刷固定化酶合成及性質表征研究

熊 科, 高思宇, 柳佳蕓, 鄧 蕾, 裴鵬鋼, 李秀婷

(北京工商大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心/北京市食品添加劑工程技術研究中心/食品質量與安全北京實驗室/北京市食品風味化學重點實驗室, 北京 100048)

堿性蛋白酶來源豐富，且具有較高的酶活力和廣泛的底物特異性，但由于一般游離酶在實際工業生產中的性質多不穩定，耐酸堿、耐熱性不強；并且液體酶會隨著時間的延長而發生降解[1]，導致生產條件難以控制，造成酶及原料的浪費。聚電解質刷因具有豐富的官能團、三維立體空間，其與蛋白質形成的復合物不但能提高蛋白質的穩定性和酶的活性[2]，還能給酶提供支撐，影響酶的微環境[3]，避免蛋白質的團聚、沉淀和變性，在蛋白質的固定方面有很大應用前景[4-6]。球形聚電解質刷是將線性聚電解質鏈接枝在球形粒子表面形成的組裝結構。目前對球形聚電解質刷的研究多集中在制備與表征方面[7-8]，對其作為酶的固定化載體，對酶活性影響的研究較少。本研究以自制納米球形聚電解質刷為載體，制備合成固定化堿性蛋白酶，并對其酶學性質進行表征，以期為固定化酶的工業發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

光引發劑Irgacure 2959，巴斯夫(中國)有限公司；丙酮，國藥集團化學試劑有限公司；吡啶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲基丙烯酰氯，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；氯仿，國藥集團化學試劑有限公司；過硫酸鉀、苯乙烯、亞硫酸氫鈉，西隴科學股份有限公司；丙烯酸，上海麥克林生化科技有限公司；硅膠，國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。堿性蛋白酶(生化試劑)，上海源葉生物科技有限公司；氮氣(高純)，北京氧利來科技發展有限公司；十二烷基磺酸鈉(優級純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；薄層層析板(Silica 60)，德國默克公司。其他試劑均為分析純。過硫酸鉀、十二烷基磺酸鈉經重結晶處理，丙酮、丙烯酸經旋蒸提純處理，均保存于4 ℃冰箱。

1.2 儀器與設備

自制紫外光反應器，北京泊菲萊科技有限公司；TSD01-1型微量注射泵，保定雷弗流體科技有限公司；Nicolet iS50型傅立葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；Zetasizer Nano ZS型激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；R300型旋轉蒸發儀，瑞士步琦有限公司；DHZ-DA型全溫振蕩器，蘇州培英實驗設備有限公司；iMark型酶標儀,美國Bio-Rad公司；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Sigma1-14型臺式離心機，美國Sigma公司。

1.3 納米球形聚電解質刷的制備

1.3.1疏水型光引發劑的合成

稱取30g的光引發劑、丙酮150 mL，30 ℃攪拌至溶解。體系冷卻后，加入10 mL吡啶,攪拌均勻。稱取13.6g甲基丙烯酰氯，溶解于50 mL丙酮中，使用微量注射泵以0.8 mL/min的速度滴加至反應體系。滴加完畢后，在冰水浴下繼續攪拌30 min，除去冰水浴，在30 ℃水浴下反應12 h。反應完畢后，獲得淺黃色產物，將其過濾除雜,25 ℃避光旋蒸，得到黃色油狀產物。

利用硅膠柱對旋蒸產物進行避光純化，洗脫液丙酮及氯仿體積比為1∶5。通過層析點板確定并收集純化后產物，得到疏水型光引發劑2-(對2-羥基-2甲基苯丙酮)-甲基丙烯酸羥乙酯(HMEM)。將產物與丙酮以質量比1∶8混合溶解，密封避光保存于4 ℃冰箱中。

1.3.2聚苯乙烯核的合成

稱取0.74 g 過硫酸鉀、0.24 g 十二烷基磺酸鈉、9.8 g苯乙烯及200 mL去離子水，先后加入到500 mL三口燒瓶中，340 r/min、35 ℃，在氮氣保護下進行反應。將0.14 g亞硫酸氫鈉溶于50 mL去離子水中，加入燒瓶。反應結束后，得到球形聚苯乙烯核乳液，并對反應體系裝置進行避光處理。稱取9.0 g光引發劑，通過微量注射泵以0.05 mL/min的流速加入到反應體系內。滴加完畢后,反應繼續進行2.5 h。反應結束后,關閉加熱器，冷卻10 min，得到聚苯乙烯核(PS)。

1.3.3光乳液聚合法制備納米球形聚電解質刷

測定聚苯乙烯核乳液的固體含量。稱取100 g乳液，加入一定量的丙烯酸單體，加入容積約為500 mL的光反應器中，加純水至整個反應體系總質量為500 g。對該系統抽真空再充氮氣循環4次，以保證整個反應在氮氣的保護下完成，并用鋁箔進行全面避光處理。反應進行40 min后，得到納米球形聚電解質刷(PS-HMEM-AA)乳液。

1.4 納米球形聚電解質刷的表征

采用透射電子顯微鏡(TEM)、傅里葉紅外光譜(FT-IR)、激光粒度儀和核磁共振氫譜(1HNMR)對納米球形聚電解質刷及固定化酶的形貌進行表征。采用FT-IR對Irgacure 2959、HMEM、PS和包裹引發劑的納米微球(PS-HMEM)的化學結構進行分析，掃描區間為 4 000～400 cm-1；采用核磁共振氫譜對光引發劑的化學結構進行分析，使用氘代丙酮作為溶劑，以四甲基硅烷為內標液，室溫下檢測；采用馬爾文激光粒度儀對載體的粒徑進行測定。

1.5 酶的固定化

稱取1 mg載體，加入酶液，漩渦混勻，4 ℃，180 r/min，震蕩吸附。吸附結束后，離心、沉淀即為固定化酶。

1.5.1酶的固定化條件的確定

其他條件不變，分別以固定化堿性蛋白酶的固定化pH值 (7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)、酶添加量 (0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL) 、固定化時間 (2、3、4、5、6、7、8 h) 作為單一變量，進行單因素實驗，得到最佳固定化酶條件。

1.5.2固定化酶性質研究

1.5.2.1 最適反應溫度和pH值的確定

分別在不同溫度和不同pH值條件下測定固定化酶和游離酶的酶活力，酶活力以最高酶活力的相對百分數來表示。

1.5.2.2 熱穩定性和酸堿穩定性的確定

取一定量的固定化酶和游離酶在同一pH值下處理3 h，在不同溫度下測定游離酶和固定化酶的活力；在相同溫度下保溫3 h，在不同 pH 值下測定游離酶和固定化酶的活力。殘余酶活力以相對于處理前酶活力的百分數來表示。

1.6 測定方法

1.6.1酶活力測定

在 40 ℃、pH值 8.0 的條件下，將單位質量(g)固定化酶在單位時間(min)內水解酪蛋白產生 1 μg 酪氨酸所需的酶量作為一個酶活力單位，以U/g表示[9]。

酶的相對活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶與游離酶活力的比值，%。

1.6.2蛋白含量的測定

采用BCA法進行蛋白含量測定，標準蛋白為牛血清蛋白，測定蛋白樣品在595 nm下的吸收值，根據標準曲線計算其中的蛋白含量。

2 結果與分析

2.1 納米球形聚電解質刷化學結構分析

2.1.1核磁共振氫譜分析結果

圖1 Irgacure 2959和HMEM的1HNMR譜Fig.1 1HNMR spectrum of Irgacure 2959 and HMEM

2.1.2紅外光譜分析結果

圖2 Irgacure 2959和HMEM的紅外光譜Fig.2 Infrared spectra of Irgacure 2959 and HMEM

圖3 PS和PS-HMEM的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of PS and PS-HMEM

2.1.3透射電子顯微鏡分析結果

圖4 樣品的TEM圖像Fig.4 TEM images of samples

對PS、PS-HMEM、PS-HMEM-AA進行TEM分析，結果如圖4。由于引發劑在聚苯乙烯微球表面的接枝厚度只有1～2 nm，因此很難從透射電鏡照片中區別。聚丙烯酸的電子云密度小，在透射電鏡下的對比度較弱，同時聚電解質鏈在高速電子沖擊下會產生降解，因此很難觀察到納米球形聚電解質刷的核殼結構[11];但通過透射電鏡的表征可以清楚看到納米球形聚電解質刷顆粒具有良好的單分散性，粒徑分布均勻，且呈現規整的球形。

2.2 聚電解質刷固定化堿性蛋白酶條件優化研究

圖5 pH值對酶固定化效果的影響Fig.5 Effect of pH values on phospholipase immobilization

圖6 酶液添加量對酶固定化效果的影響Fig.6 Effect of enzyme dosages on phospholipase immobilization

圖7 固定化時間對酶固定化效果的影響Fig.7 Effect of reaction time on phospholipase immobilization

堿性蛋白酶固定化條件的單因素實驗結果見圖5到圖7。聚電解質對于pH值非常敏感，不同 pH值條件下聚電解質間的相互作用及控制聚電解質的有效電荷密度不同[12]。從圖5可以看出，pH值為9.0時酶活力達到最高。從圖6可以看出，在加酶量較低時，酶活力隨著加酶量的增加而提高，當加酶量達到1.2 mg/mL后，繼續加大酶量，固定化酶的酶活反而會下降。這是由于一定量的載體可以固定的酶量是一定的，當載體固定化位點達到飽和，再繼續添加酶反而會使酶分子聚集成團，使酶分子之間的活性位點彼此覆蓋，空間位阻增大，對酶活產生抑制作用,使酶的利用率下降。從圖7可以看出，酶活力在初始階段隨著時間的增加而提高，在6 h時達到最高，繼續增加固定化時間，酶活力基本保持不變。原因是在初始階段隨著時間的推移，酶分子不斷固定到載體上，當載體上活性基團連接的酶分子達到飽和后，繼續增加時間，酶分子與載體也不會發生有效的固定化反應，酶活力和蛋白固載率基本保持不變。綜合分析結果，選擇pH值為9.0，加酶量1.2 mg/mL，固定化6 h作為優化的固定化堿性蛋白酶條件。

2.3 游離酶及固定化酶酶學性質對比分析

2.3.1溫度對酶活性的影響

在不同溫度下測定游離酶和固定化酶的酶活性，以酶活力最大的組為100%，其余各組的酶活力與最大酶活力之比即為相對酶活力，結果見圖8。由圖8可知，堿性蛋白酶游離酶的最適反應溫度為 45 ℃，固定化酶的最適反應溫度為 60 ℃，最適溫度提高15 ℃。溫度繼續升高，由于酶活性部位受到高溫破壞導致酶活力下降，而游離酶酶活力的下降速度明顯比固定酶快。聚電解質能防止熱力學誘導的蛋白質變性，從而保證蛋白質的穩定性。固定化使酶的結構更穩定，蛋白的變性溫度升高，使其對溫度的耐受程度得到提高[12]。

圖8 溫度與游離酶和固定化酶活性的關系Fig.8 Effect of temperature on activity of free enzymes and immobilized enzymes

2.3.2pH值對酶活性的影響

在不同pH值條件下測定游離酶和固定化酶的活性，結果見圖9。聚電解質刷鏈層中反離子的富集和釋放使聚合物刷的空間結構發生改變，導致聚合物鏈的伸展和塌陷，弱聚電解質刷的鏈伸展隨pH值變化[13]。束縛于聚電解質刷中的反離子產生高滲透壓使聚合物刷“溶脹”，可為反離子富集和生物分子固定提供空間。球形聚電解質刷內部能保持pH值相對穩定，吸附大量的生物分子后能極大地保留生物分子的功能和活性[14]。由圖9可知，游離酶的最適反應pH值為11.0，固定化酶的最適反應pH值為9.0，分析可能是固定化載體材料使酶的微觀環境發生變化。固定化酶相對于游離酶可在較寬酸堿范圍內保持較高活性，表明固定化酶 pH值適用范圍更加寬泛，酸堿穩定性比游離酶更好。說明酶固定在載體上后，酶分子的構象更加穩定，使得酶對pH值的敏感性降低。

圖9 pH值與游離酶和固定化酶活性的關系Fig.9 Effect of pH values on activity of free enzymes and immobilized enzymes

2.3.3熱穩定性分析

對處理后的固定化酶和游離酶進行酶活性測定，觀察其酶活力的變化規律，結果見圖10。從圖10中可以看出：經 60 ℃熱處理后，游離酶、固定化酶幾乎完全失活，但固定化酶的熱穩定性在很寬的溫度范圍內均呈現升高趨勢。圖10表明，載體表面的柔性聚合物鏈對酶蛋白的包裹，增加了酶的緊密度，有效地避免了酶蛋白與剛性的載體表面接觸發生構型變化而導致酶活性喪失[15]。聚合物鏈與酶蛋白分子活性中心的相互作用更加穩定了酶分子構象[16]，從而減少了其高熱致構象變化的可能，對保持蛋白活性、提高酶分子的抗熱失活的能力起著重要作用。

圖10 游離酶和固定化酶的熱穩定性Fig.10 Thermal stabilities of free and immobilized enzymes

2.3.4酸堿穩定性分析

對處理后的固定化酶和游離酶進行酶活性測定，觀察其酶活力的變化規律，結果見圖11。從圖11中可以看出：固定化酶在pH 值為7.5～11.0時，酶活力均在90%以上，固定化酶相對于游離酶可在較寬酸堿范圍內保持較高活性。球形聚電解質刷能極大地保留酶的活性[17]，酶蛋白被聚電解質鏈包裹后，其分子構象更加牢固，提高了酶的剛性，減少酸堿變化過程中構象的變化，從而提高了酸堿穩定性。

圖11 游離酶和固定化酶的酸堿穩定性Fig.11 Acid-base stabilities of free and immobilized enzymes

3 結 論

通過 TEM、FT-IR、1HNMR對納米球形聚電解質刷的形貌、結構等進行了表征。微球呈規則圓形，單分散性良好。用FT-IR、1H NMR分析微球的特征官能團結構，結果表明：引發劑成功改性為疏水型光引發劑，丙烯酸單體成功接枝到聚苯乙烯微球表面，得到納米球形聚電解質刷載體。球刷固定化堿性蛋白酶最適溫度提高15 ℃，熱穩定性、酸堿穩定性均有所提高；相對于游離酶，經納米球形聚電解質刷固定化后，酶的活性中心構象更穩固，削弱了不利因素對酶活性的影響，增加了固定化酶的穩定性，有利于其工業化應用。今后，在固定化酶的研究方面還需要不斷對固定化酶的載體和固定化方法加以創新，尋找到經濟合理、穩定性高、固定化效果好的酶固定化方法，減少對游離酶的浪費，降低其工業生產成本。