煙曲霉脂肪酶B在畢赤酵母中的表達及酶學性質研究

唐 薇，黃偉謙，楊 博,*，王永華，藍東明

(1.華南理工大學 食品科學與工程學院， 廣東 廣州 510641；2.華南理工大學 生物科學與工程學院， 廣東 廣州 510006)

脂肪酶(EC 3.1.1.3) 是一類廣泛存于動物、植物及微生物中，可以催化酯類水解、合成和酯交換的α/β折疊水解酶。脂肪酶被廣泛應用于近代的新材料、食品加工、醫藥、化學合成、生物能源等行業，是重要的工業生物催化劑之一[1-2]。1990年，對米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucormieheilipase, RML)相關研究的首次報道[3]，掀起了一輪脂肪酶研究熱潮，使得人們對脂肪酶分子的空間結構和催化機理都有了進一步了解。來源不同種屬的、具有不同特性的脂肪酶，不僅僅對工業化生產有重大的應用前景，而且對推動相關科學研究也具有十分深遠的意義。

南極假絲酵母脂肪酶B(Candidaantarcticalipase B, CALB)是一種具有寬泛的底物特異性、高對映選擇性，以及在水和非水環境中均具有強穩定性的生物催化劑，是工業生產和科學研究中使用最為廣泛的脂肪酶[4-5]。Sonseca等[6]利用CALB，高效合成了新型的生物降解塑料——聚丁二酸丁二酯- 丁二酸雙亞麻油酸二醇酯(poly(butylene succinate-co-dilinoleic succinate))；Alalla等[7]利用CALB動力學，拆分了一種重要的藥物化學中間體β-氨基醇；而當前已報道的CALB家族脂肪酶屈指可數[8]，大多數CALB家族類脂肪酶研究只停留在基因預測階段，并沒有被表達和表征。挖掘新型CALB家族脂肪酶并深入研究其特性，可進一步滿足不同工業應用的需求；同時可拓寬對CALB家族脂肪酶的認識，為進一步應用蛋白質工程改造CALB家族脂肪酶提供理論基礎。

當前已報道的CALB家族脂肪酶除了CALB，還包括來源于阿氏絲孢酵母MSR54(TrichosporonasahiiMSR54)[9]、玉米黑粉病菌521(Ustilagomaydis521)[10]、皺波褶尾菌(Plicaturopsiscrispa)[8]、湖北假酵母SY62(PseudozymahubeiensisSY62)[11]、絲黑穗病菌SRZ2(SporisoriumreilianumSRZ2)和橡膠假酵母GHG001(PseudozymabrasiliensisGHG001)[12]的脂肪酶，并且僅有前3個酶的酶學性質被表征及深入研究。本研究克隆了來源于煙曲霉(AspergillusfumigatusGIM3.20)的GALB家族的脂肪酶B(AFLB)基因，并在畢赤酵母中表達，分析了AFLB的序列特征；研究了重組脂肪酶AFLB的酶學特性，以期為AFLB的工業應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

大腸桿菌E.coliDH5α菌株、畢赤酵母GS115及表達載體pPIC9K-His均為本實驗室保存；AspergillusfumigatusGIM3.20，購自廣東省微生物菌種保藏中心；反轉錄cDNA第一鏈合成試劑盒、RNAiso Plus試劑盒、PrimeSTAR Max、限制性內切酶(EcoRI、NotI、SalI)和T4 DNA lingase，均購自寶生生物科技有限公司；Ni Sephraose 6 Fast Flow 和 Desalting脫鹽柱，購自 GE Healthcare Life Sciences(UK)；基因引物、DNA膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒，購自上海生工生物科技有限公司。其他試劑皆為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1脂肪酶AFLB基因分析

利用Vector NTI 10 軟件(美國Invitrogen 公司)，對AFLB的cDNA序列進行翻譯并獲得對應的氨基酸序列。利用ExPASy (https://www.expasy.org/)線上軟件分析等電點和蛋白質分子量，并利用Blast P ( http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ) 分析序列相似性。

1.2.2脂肪酶AFLB基因的克隆與載體構建

脂肪酶AFLB成熟肽利用軟件 Primer Premier 5 設計引物如下：上游引物為5′-TCAGAATTCGCAGTCATTCCCCGCGGC′(下劃線部分為EcoR I 酶切位點)，下游引物為 5′- ATTGCGGCCGCTATGAGCGTAGCTCGCAATGG′ (下劃線部分為Not I酶切位點)。參照文獻 [13]的方法，提取A.fumigatusGIM3.20的總RNA并反轉錄為cDNA，以該cDNA為模板，PCR 擴增脂肪酶AFLB基因片段。PCR具體過程：98 ℃預變性3 min，98 ℃變性5 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸80 s，進行32個循環，于4 ℃下保存。將PCR 產物電泳檢測并割膠回收。PCR產物與質粒pPIC9K-His經EcoR I和Not I雙酶切并進行產物純化回收，使用T4 DNA lingase 將目的基因片段與表達載體片段進行連接，連接產物轉化至E.coli DH5α細胞。將重組菌涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板，37 ℃恒溫箱放置12 h，挑選陽性菌株并測序鑒定。

1.2.3脂肪酶 AFLB表達和純化

使用SalI內切酶將測序驗證無誤后的質粒pPIC9K-AFLB-His線性化并進行產物純化回收。將線性化質粒產物電轉化GS115感受態細胞，涂布到葡萄糖基礎培養基(MD)平板，30 ℃恒溫箱培養3 d。挑取單菌落接種于5 mL YPD液體培養基中，30 ℃、200 r/min培養20 h后轉接至100 mL BMGY液體培養基中，30 ℃、200 r/min下培養24 h。在超凈臺中靜置30 min，去掉上清液，加入200 mL無菌BMMY液體培養基重懸菌體，28 ℃、200 r/min下培養，每隔24 h加入2 mL甲醇，總共誘導96 h。將發酵后的菌體液在4 ℃，10 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液并用0.45 μm的濾膜進行過濾，濾過液轉至膜包進行濃縮，濃縮至原體積的1/10。將上清濃縮液加到50 mmol/L、pH值7.4的磷酸緩沖溶液預先平衡的鎳柱(Ni Sephraose 6 Fast Flow)中，用25 mmol/L咪唑緩沖溶液梯度沖洗雜蛋白，用125 mmol/L的咪唑緩沖溶液沖洗目的蛋白。接著用Desalting 脫鹽柱對目的蛋白洗脫液進行脫鹽處理，最終純化后的脂肪酶AFLB溶解在50 mmol/L、pH值為7.0的磷酸緩沖溶液中。使用SDS-PAGE凝膠電泳對純化樣品進行檢測。

1.2.4脂肪酶 AFLB的活性測定與酶學性質表征

1)脂肪酶活性的測定。采用滴定法測定脂肪酶活性[14]。在1 min內，水解三丁酸甘油酯乳化液底物，釋放1 μmol脂肪酶酸所需的酶量定義為一個酶活單位。

2)脂肪酶AFLB最適反應pH值的測定。在50 mmol/L不同pH值的緩沖體系中，包括甘氨酸- 鹽酸(pH值 3.0)、檸檬酸鈉/檸檬酸( pH 值4.0～5.0)、Na2HPO4/NaH2PO4( pH 值6.0～7.5)、Tris-HCl ( pH值 8.0～9.0)，在40 ℃，測定不同pH值緩沖液中脂肪酶AFLB的水解活力。以相應pH值下的酶活力為100%，其余的以相對酶活力表示。

3)脂肪酶 AFLB 最適反應溫度及熱穩定性的測定。將反應混合液分別置于 pH 值7.0、50 mmol /L磷酸緩沖溶液( 10～70 ℃) 中，孵育10 min，加入等量的脂肪酶AFLB，分別在不同溫度下反應15 min，測定不同溫度下脂肪酶的活力。同樣，以相應溫度下的酶活力為100%，其余的以相對酶活力表示。分別將適量的脂肪酶AFLB純酶液置于不同溫度(30、50、60、70 ℃) 的水浴鍋進行水浴，每隔一定時間分別取樣并測定該酶液的殘余酶活力。以熱處理前的酶活力為100%，其余的以相對酶活力表示。

4)脂肪酶 AFLB 鈉鹽耐受性的測定。分別將一定量的脂肪酶AFLB純酶液與不同質量的NaCl混合，制得含有不同質量濃度(0～6 mol /L)NaCl 的AFLB酶溶液， 30 ℃靜置2 h后測定各酶液樣品的殘余酶活力。以無加入NaCl的酶活力為100%，其余的以相對酶活力表示。

5)脂肪酶AFLB底物特異性的測定。使用比色法[15]，分別將不同長度酰基的對硝基苯酯(C2～C16)作為脂肪酶AFLB的底物，在最適條件下測定對該底物的酶活力。以無加入脂肪酶的酶活力作為平行對照組，以相應底物的酶活力為100%，其余的以相對酶活力表示。

2 結果與討論

2.1 脂肪酶AFLB的序列分析

AFLB的基因擴增檢測結果見圖1。由圖1可知，從AspergillusfumigatusGIM3.20中克隆的脂肪酶AFLB基因片段的大小與理論相符；測序結果顯示，該AFLB基因片段包含1 320 bp，與NBI數據庫中的基因XM_744013相應片段的一致性達到99%，其中唯一一個錯配堿基是G364，對應AFLB的C295。ExPASy分析顯示，該脂肪酶成熟肽含有440個氨基酸殘基，理論蛋白質分子質量為46.7 Da，理論等電點為5.14； NetNGlyc分析顯示，N25為潛在的N-糖基化位點。NCBI序列比對結果顯示：AFLB的氨基酸序列與來自費舍爾曲霉(A.fischeriNRRL 181)的脂肪酶氨基酸序列有94% 的一致性，與烏達加瓦曲霉(A.udagawae)脂肪酶序列有92%的一致性，與A.turcosus、棒曲霉NRRL 1(A.clavatusNRRL 1)、黑曲霉(A.niger)、擴展青霉(Penicilliumexpansum)和希金斯刺盤孢菌(Colletotrichumhigginsianum)脂肪酶序列的一致性分別為83%、73%、60%、51%和45%，但這些序列均來自全基因組測序，并沒有進行酶學性質研究。將AFLB序列與the Lipase Engineering Database(http://www.led.uni-stuttgart.de/)中的序列比較分析，發現AFLB 屬于C.antarctica脂肪酶 B(CALB)家族成員 (abH37.01)，其中，AFLB與CALB的氨基酸序列一致性達到31%。AFLB與已報道的CALB 家族脂肪酶的序列比對結果見圖2。圖2表明， AFLB 含有與家族其他成員類似的保守五肽序列(SWSQG)，預測AFLB的催化三聯體分別為S233、D318和H361，其中Ser233位于保守五肽序列中。CALB蛋白分子中包含三對二硫鍵，而AFLB可能只保留其中一對二硫鍵(C350-C395)。相比其他已報道的CALB家族脂肪酶，AFLB具有一段含有128個氨基酸殘基的N-端延長序列(圖2)，結合NCBI序列比對結果，發現該N-端延長片段為曲霉屬(Aspergillus.sp)脂肪酶B的特征序列，并且該片段的具體功能有待研究。

圖1 AFLB基因擴增檢測結果Fig.1 Analysis of AFLB genes amplified from PCR

★：催化三聯體；■： 保守五肽序列圖2 脂肪酶AFLB 全序列比對結果Fig.2 Multiple sequence alignment of lipase AFLB

2.2 脂肪酶AFLB表達與純化結果

利用甲酵誘導基因工程畢赤酵母菌(pPIC9K-AFLB-His)胞外高效表達重組脂肪酶AFLB。利用Ni Sephraose 6 FF柱層析等純化手段，最終獲得的脂肪酶AFLB蛋白質質量濃度為140 μg/mL。AFLB蛋白質表達與純化結果見圖3。圖3中，SDS-PAGE檢測顯示，125 mmol/L咪唑洗脫的樣品中，含有兩條目的蛋白質條帶，大條帶大小為45～66 kDa，該條帶可能是高度糖基化的蛋白；小條帶大小約為42 kDa，與理論大小46.7 kDa有較小差距。可以推測，AFLB蛋白的N端片段被宿主酵母菌的內肽酶不完全水解，導致部分AFLB酶蛋白的N端片段(1～50位氨基酸殘基)缺失；而預測的糖基化位點N25正好在被切除的片段當中，使得去掉部分N端片段的AFLB主體蛋白去糖基化并且分子質量略小于理論分子質量。

泳道1：AFLB的發酵上清液；泳道2：125 mmol/L咪唑緩沖液洗脫蛋白；泳道3：500 mmol/L咪唑緩沖液洗脫蛋白；泳道M：中低分子質量蛋白marker。圖3 脂肪酶 AFLB的蛋白質表達及純化結果Fig.3 Expression and purification of AFLB

2.3 脂肪酶AFLB的酶學性質分析

圖4 pH值對脂肪酶AFLB 活性的影響Fig.4 Effects of pH values on activity of lipase AFLB

圖5 溫度對脂肪酶AFLB酶活性和熱穩定性的影響Fig.5 Effect of temperature on activity and thermostability of lipase AFLB

脂肪酶AFLB最適反應pH值測定結果見圖4。圖4中脂肪酶AFLB在pH值為7.0的50 mmol/L磷酸緩沖液中水解活性最高；而pH值為7.5～9.0時，脂肪酶AFLB活性迅速下降；在pH值 5.0～7.0，AFLB的活力不低于最高活力的87.3%。脂肪酶AFLB最適反應溫度與熱穩定性測定結果見圖5。由圖5(a)可知，在最適反應pH值條件下，脂肪酶ALFB催化水解三丁酸甘油酯反應的最適溫度為40 ℃，而酶在30～50 ℃條件下，水解活力達到最高活力80%以上。由圖5(b)可知，AFLB在50 ℃以下相對穩定，50 ℃孵育150 min后仍保持87.9%的活力。當溫度在60 ℃以上，AFLB的穩定性明顯變弱。60 ℃孵育150min后，AFLB的殘余酶活力只有16.8%；在70 ℃環境下孵育20 min基本可以使酶失活。有趣的是，脂肪酶AFLB在高濃度的NaCl溶液(1～6 mol/L)下孵育120 min后，仍然保存原有活力，見圖6。圖6表明，脂肪酶AFLB是一種耐鈉鹽的脂肪酶。利用對硝基苯酯作為底物研究脂肪酶AFLB底物偏好性，結果如圖7所示。該酶對脂肪酸碳鏈長2～16的對硝基苯酯都具有水解活性，其中最適的底物是肉豆蔻酸對硝基苯酯。

圖6 NaCl濃度對脂肪酶AFLB穩定性的影響Fig.6 Effects of concentrations of NaCl on stability of lipase AFLB

C2～C14：不同長度酰基的對硝基苯酯圖7 脂肪酶AFLB對不同對硝基苯酯的水解活性Fig.7 Relative activity of lipase AFLB toward p-nitrophenyl esters

3 結 論

從煙曲霉AspergillusfumigatusGIM3.20中克隆得到一個CALB家族脂肪酶基因AFLB。經過對AFLB的序列分析，發現AFLB與CALB的氨基酸序列有31%的一致性，兩者同屬abH37.01家族，與已報道的CALB家族脂肪有著一定的親緣關系。AFLB具有一段N-端延長片段，是曲霉屬脂肪酶B的特有序列，其結構與功能關系有待下一步研究。在畢赤酵母GS115中成功對AFLB進行異源表達，并利用Ni柱親和層析純化得到了重組蛋白。酶學性質研究發現，重組脂肪酶AFLB最適反應pH 值為7.0，最適反應溫度為40 ℃，在50 ℃以下具有較好的熱穩定性，并且具有良好的鈉鹽耐受性，其最適底物為肉豆蔻酸對硝基苯酯。