基于一測多評法的丹參酮提取物質(zhì)量控制△

郭龍，薛紫鯨，劉愛朋，張丹，鄭玉光*

1.河北中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河北 石家莊 050200；2.河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050200

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)。丹參具有通經(jīng)止痛、活血祛瘀、清心除煩、涼血消癰等功效，用于胸痹心痛、癥瘕積聚、熱痹疼痛、心煩不眠、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、瘡瘍腫痛[1]。丹參中的化學(xué)成分根據(jù)極性差異可以分為脂溶性成分和水溶性成分。脂溶性成分主要為丹參酮類化合物，如丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I和二氫丹參酮I等；水溶性成分主要為酚酸類化合物，如丹酚酸A、丹酚酸B和丹酚酸C等[2-3]。

丹參酮提取物為丹參的干燥根及根莖加工制成的提取物，主要含有脂溶性的丹參酮類成分[1，4]，收載于《中華人民共和國藥典》(2015版)。研究表明，丹參酮提取物具有抗氧化、抗炎、抗心肌缺血、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等多方面的藥理活性，臨床中主要用于心腦血管疾病的治療[5-7]。丹參酮提取物主要含有脂溶性的丹參酮類成分，丹參酮類成分結(jié)構(gòu)相似、種類眾多，導(dǎo)致丹參酮提取物質(zhì)量控制較為困難。已有報道采用高效液相色譜法，以丹參酮IIA和隱丹參酮等成分為指標，對丹參酮提取物質(zhì)量進行評價[8-9]，但這些方法存在著指標成分過少，對照品消耗量大，操作復(fù)雜等缺陷。《中華人民共和國藥典》中以丹參酮IIA和隱丹參酮作為定性和定量指標對丹參酮提取物進行質(zhì)量控制，但除了上述有效成分之外，尚需建立更多活性成分如丹參酮I、二氫丹參酮I等的定量分析方法，以期對丹參酮提取物的質(zhì)量標準進行提高與完善。

中藥及其制劑具有“多成分、多靶點、整合作用”特點，決定了任何單一成分都難以準確表達中藥及其制劑的整體質(zhì)量，因此，多指標綜合質(zhì)量控制模式成為中藥質(zhì)量評價的發(fā)展趨勢[10-11]。但是，在實際工作中，標準品獲得的困難、單體不穩(wěn)定或價格昂貴等問題成為了限制中藥多指標質(zhì)量控制方法建立與推廣應(yīng)用的主要技術(shù)瓶頸。一測多評方法利用藥材各有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，達到測定一個易得標準品的含量，來實現(xiàn)多個成分含量同時測定的目的，可以較好解決標準品不易獲得的難題，在中藥及其制劑多成分、多指標質(zhì)量控制中有廣泛應(yīng)用[12]。

綜上所述，本研究擬采用一測多評方法，建立丹參酮提取物中4種丹參酮類成分(丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I和二氫丹參酮I)的含量測定方法，以期為丹參酮提取多成分含量測定提供新方法，為丹參酮提取物的質(zhì)量控制提供更科學(xué)、更準確的評價模式。

1 材料

Aglient 1290液相色譜儀、Aglient 1260液相色譜儀(四元泵、DAD檢測器)；Shimadzu LC-20液相色譜儀(二元泵、紫外檢測器)；色譜柱：Aglient Extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Therom BDS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Inerisil ODS-SP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Mettler-Toledo XS205 DU型電子分析天平；KS-5200B超聲波清洗儀(昆山潔立美超聲儀器有限公司)。

二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA(成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為MUST-17032705、MUST-17030403、MUST-17030210、MUST-17022502)經(jīng)高效液相色譜檢測，純度均大于98%(圖1)。丹參酮提取物(TE1～TE3)購自于陜西天之潤生物科技有限公司。乙腈和甲酸(ROE公司，色譜級)；去離子水用Milli-Q系統(tǒng)制備；其他試劑均為分析純。

注：1.二氫丹參酮I；2.隱丹參酮；3.丹參酮I；4.丹參酮IIA。圖1 二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜分離采用Agilent Extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：25 ℃；梯度洗脫，洗脫程序：0～10 min，60%B；10～40 min，60%～80%B，保持80%B運行5 min后，回到起始梯度，每次進樣前以初始梯度平衡10 min；檢測波長270 nm。上述色譜條件下，二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA 4個丹參酮類成分的分離度良好，色譜圖見圖2。

注：A.混合對照品；B.丹參酮提取物樣品；1.二氫丹參酮I；2.隱丹參酮；3.丹參酮I；4.丹參酮IIA。圖2 混合對照品和丹參酮提取物樣品HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取二氫丹參酮I 1.74 mg、隱丹參酮2.53 mg、丹參酮I 1.82 mg、丹參酮IIA 1.95 mg至25 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成含二氫丹參酮I 69.6 mg·L-1、隱丹參酮101.2 mg·L-1、丹參酮I 72.8 mg·L-1、丹參酮IIA 78 mg·L-1的混合對照品溶液，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取丹參酮提取物粉末5 mg，加入1 mL甲醇，100 kHz超聲提取30 min，室溫下冷卻，加甲醇補足減少的質(zhì)量后，13 000 r·min-1離心10 min，取上清，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系、定量限及檢測限 將混合對照品溶液用甲醇稀釋成一系列的梯度濃度溶液后，按2.1項下色譜條件進樣分析，以待測化合物峰面積對濃度進行線性回歸，得到各成分標準曲線。在定量范圍內(nèi)各化合物的線性良好(r>0.999 7)，另以適宜濃度的標準品溶液逐級稀釋后進樣分析，分別測定各待測成分信噪比(S/N為10和3時的濃度計為定量限和檢測限)，結(jié)果見表1。

2.4.2 精密度試驗 分別考察所建立的分析方法的日內(nèi)精密度和日間精密度。取丹參酮提取物樣品(TE1)，按2.3項下制備樣品，在一天內(nèi)連續(xù)進樣6針，記錄各個化合物的峰面積，計算RSD，考察日內(nèi)精密度；將上述樣品連續(xù)3 d每天進樣3針，RSD，考察日間精密度。結(jié)果顯示，二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA的日內(nèi)精密度分別為0.45%、0.64%、0.50%、0.57%，日間精密度為0.92%、0.55%、0.43%、0.48%。由日內(nèi)、日間精密度考察結(jié)果可知，所建立分析方法的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 精密稱取丹參酮提取物(TE1)樣品粉末6份，每份5 mg，按2.3項下方法平行制備供試品溶液。計算各化合物的含量，并計算測定結(jié)果的RSD。二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA的RSD分別為0.75%、0.95%、0.87%、0.91%，結(jié)果表明所建立的分析方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取丹參酮提取物(TE1)供試品溶液，于供試品溶液制備后0、2、4、6、8、12、24 h進樣分析，記錄各化合物的峰面積并計算RSD，結(jié)果顯示，二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA峰面積的RSD分別為0.82%、0.87%、1.68%、0.18%。結(jié)果表明，所測定的4個丹參酮類成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的丹參酮提取物(TE1)粉末5 mg，平行9份，分別加入4個丹參酮化合物對照品適量(高、中、低濃度各3份)，按2.3項下方法制備供試品溶液，進樣分析，記錄各化合物的峰面積，計算各成分的含量。根據(jù)以下公式計算回收率。

(1)

4個丹參酮成分的加樣回收率試驗結(jié)果見表2。二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA的平均加樣回收率分別為100.67%、99.66%、100.82%、100.02%，RSD分別為3.49%、2.21%、2.93%、3.35%。加樣回收率結(jié)果表明，所建立的分析方法準確性良好。

表1 4種丹參酮類成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限和檢測限 mg·L-1

表2 4種丹參酮類成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=3)

2.5 一測多評方法的建立

2.5.1 相對校正因子和相對保留時間的計算 化合物在一定范圍內(nèi)(線性范圍)成分的量(濃度)與紫外檢測器響應(yīng)成正比，在中藥多指標質(zhì)量評價時，選取其中對照品易得、藥材中含量較高且穩(wěn)定的一個成分作為內(nèi)標物，建立該內(nèi)標物與其他待測成分之間的相對校正因子(RF)；在實際測定時，用外標法測定內(nèi)標物的含量，再通過相對校正因子計算其他待測組分的含量，從而實現(xiàn)只用一個對照品(內(nèi)標物)，實現(xiàn)多個待測組分的含量測定[13]。

本實驗中以丹參酮IIA為內(nèi)標物，對丹參酮類化合物建立一測多評分析方法，各化合物的相對校正因子(RFX)根據(jù)以下公式計算：

(2)

其中Csi和Cxi分別表示內(nèi)標化合物和待測化合物的質(zhì)量分數(shù)(mg·g-1)，Rsi和Rxi表示內(nèi)標化合物和待測化合物在對應(yīng)濃度下的響應(yīng)值，i為不同濃度梯度，每個化合物均在7個不同濃度下測試并計算，即n=7。

化合物的相對保留時間(RRT)可以用于樣品色譜圖中峰的標定和指認。化合物相對保留時間(RRTX)根據(jù)以下公式計算：

RRTX=RTX/RTS

(3)

其中RTX為待測化合物的保留時間(min)，RTS為內(nèi)標化合物的保留時間(min)。

以丹參酮IIA為內(nèi)標物，根據(jù)以上公式計算得二氫丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮I的相對校正因子分別為1.55、1.12、1.28，相對保留時間分別為0.44、0.65、0.70。

2.5.2 系統(tǒng)耐用性考察 為了考察所建立一測多評方法的系統(tǒng)耐用性，針對不同色譜柱、不同色譜儀器、不同流速和不同柱溫等方面考察不同因素對于各化合物相對校正因子和相對保留時間的影響[14]。

不同儀器和不同色譜柱對RF和RRT的影響：選取3種色譜柱(Aglient Extend C18色譜柱、Therom BDS C18色譜柱和Inerisil ODS-SP色譜柱)和3種液相色譜系統(tǒng)(Aglient 1260液相色譜系統(tǒng)、Aglient 1290液相色譜系統(tǒng)和Shimadzu LC-20液相色譜系統(tǒng))對各丹參酮化合物的RF和RRT進行了考察。結(jié)果表明(表3)，二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I的RF和RRT的RSD分別在2%～5%，表明所建立的一測多評方法具有良好的重復(fù)性和適應(yīng)性。

不同流速對RF和RRT的影響：采用Aglient 1260液相色譜系統(tǒng)和Agilent Extend C18色譜柱分別在不同流速(0.8、0.9、1、1.2 mL·min-1)下測定各化合物的RF和RRT。結(jié)果表明(表4)，在不同流速下二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I的RF和RRT重復(fù)性良好，RSD分別在0.64%～1.11%和1.90%～3.27%。

不同柱溫對RF和RRT的影響：采用Aglient 1260液相色譜系統(tǒng)和Agilent Extend C18色譜柱在不同柱溫(20、25、30 ℃)下測定各化合物的RF和RRT。結(jié)果顯示(表5)，不同柱溫對二氫丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮I的RF和RRT影響較小，RSD分別在0.52%～0.98%和1.45%～2.44%。

由系統(tǒng)耐用性考察結(jié)果可知，二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I的RF和RRT受不同的色譜柱、不同液相色譜系統(tǒng)、不同流速和不同柱溫等因素的影響較小，所建立的一測多評方法系統(tǒng)耐用性良好。

表3 不同儀器和不同色譜柱測得的相對校正因子和相對保留時間

表4 不同流速下測得的相對校正因子和相對保留時間

表5 不同柱溫下測得的相對校正因子和相對保留時間

2.6 一測多評法與外標法含量測定結(jié)果比較

經(jīng)方法學(xué)優(yōu)化和考察后，采用以上建立的一測多評方法，對3批丹參酮提取物(TE1～TE3)中的二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA 4個活性丹參酮類成分的含量進行了測定。按照2.3項下方法制備丹參酮提取物樣品溶液，按2.1項下色譜條件進行分析，分別測定二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA的含量(圖2)。3批丹參酮提取物含量測定結(jié)果見表6，丹參酮類成分的總含量分別為23.64%、19.54%和19.14%。3批丹參酮提取物中，丹參酮IIA的含量均最高，分別為10.75%、10.79%和10.48%。

為了考察一測多評方法的準確性，把一測多評法(SSDMC)的測定結(jié)果與外標法(ESM)測定結(jié)果進行了比較。以準確度(Accuracy)來評價所建立的一測多評方法的可行性，準確度由以下公式計算：

準確度(%)=CS/CE×100%

(4)

其中，CS表示一測多評法計算所得的含量，CE表示通過外標法計算所得的含量。

為了考察一測多評法的準確性，比較了外標法和一測多評法的測定結(jié)果。采用一測多評法和傳統(tǒng)外標法所測得的各成分的含量結(jié)果基本一致，通過t檢驗對兩種方法測得的含量結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果表明，以丹參酮IIA為內(nèi)標物建立的一測多評方法具有較好的準確性和可行性，測定結(jié)果準確可靠，可以用于丹參酮提取物的質(zhì)量控制。

表6 丹參酮提取物中4種丹參酮類成分一測多評法和外標法含量測定結(jié)果(n=3) %

3 討論

在中藥多成分一測多評方法建立中，一般選取對照品易得、藥材中含量較高且穩(wěn)定的成分作為內(nèi)標物。丹參酮IIA具有抗炎、抗氧化、抗心肌缺血、抗腫瘤等多種藥理活性，是丹參酮提取物中的主要活性成分之一[15]。丹參酮IIA對照品相對價廉易得，穩(wěn)定性較好，且在丹參酮提取物中含量較高，因此本實驗中選擇丹參酮IIA為內(nèi)標物，建立丹參酮提取物中4個主要活性丹參酮類成分的一測多評方法，用于丹參酮提取物的質(zhì)量控制。

為了確定一測多評方法的檢測波長，采用DAD檢測器對4個丹參酮類化合物進行全波長掃描，各化合物的紫外吸收光譜見圖3。由結(jié)果可知，二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮IIA最大吸收波長分別為240、245、265、270 nm。因為實驗中選擇丹參酮IIA為內(nèi)標化合物，因此將檢測波長設(shè)為其最大吸收波長270 nm。

為了獲得最好的色譜分離效果，分別對流速(0.8、0.9、1.0、1.2 mL·min-1)、柱溫(20、25、30 ℃)及流動性pH(純水和0.1%甲酸)進行了考察。最終確定最優(yōu)色譜條件為0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速0.8 mL·min-1；柱溫30 ℃。

本實驗中考察不同儀器、不同色譜柱、不同流速和不同柱溫等因素對相對校正因子和相對保留時間的影響，結(jié)果表明，不同儀器、不同色譜柱、不同流速和不同柱溫下測得各丹參酮類成分的相對校正因子和相對保留時間基本一致，相對校正因子的RSD小于2%，相對保留時間的RSD小于5%，說明所建立的一測多評方法系統(tǒng)耐用性良好，可用于丹參酮提取物中4個丹參酮類成分的含量測定。

采用所建立的一測多評方法，以丹參酮IIA為內(nèi)標物對3批丹參酮提取物的二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA4個丹參酮類成分的含量進行了測定，結(jié)果表明，3批丹參酮提取物之間的質(zhì)量基本一致，差異不明顯。4個活性丹參酮類成分的總含量在19%～24%。為了進一步考察所建立的一測多評方法的準確性，將一測多評法的測定結(jié)果與外標法測定結(jié)果進行了比較，結(jié)果表明，兩種方法測定的結(jié)果基本一致，提示所建立的一測多評方法準確度和可靠性良好，可用于丹參酮提取物的多成分含量測定及質(zhì)量控制。

注：A.二氫丹參酮I；B.隱丹參酮；C.丹參酮I；D.丹參酮IIA。圖3 二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的紫外光譜圖

綜上所述，本實驗建立了以丹參酮IIA為內(nèi)標物的丹參酮提取物的一測多評法，同時測定了丹參酮提取物中二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的含量。所建立的方法具有較好的重復(fù)性、穩(wěn)定性和準確度，可用于丹參酮提取物的多成分含量測定及質(zhì)量控制。本研究提升了中華人民共和國藥典中丹參酮提取物的質(zhì)量控制標準，為其進一步應(yīng)用和推廣提供了技術(shù)支撐。一測多評法作為一種全新的多指標質(zhì)量評價模式，有助于解決中藥多成分質(zhì)量控制中對照品匱乏的瓶頸問題，實際運用具有較高的可行性、可推廣性。