黑參中人參皂苷Rg3的含量測定△

朱連連，欒曉寧，竇德強(qiáng)

遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

黑參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey經(jīng)過九蒸九曬等炮制工藝加工而成的一種繼紅參之后的人參新加工炮制品，目前還沒有被《中華人民共和國藥典》所記載，黑參最早產(chǎn)于韓國，經(jīng)過九蒸九曬等炮制工藝加工而成[1]。近幾年我國也在對黑參進(jìn)行開發(fā)研究，黑參比生曬參、紅參有更強(qiáng)的生物活性，如抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能、降血糖、抗腫瘤等[2]。人參皂苷Rg3屬于稀有皂苷，是黑參的主要成分，具有明顯的生理活性，因此建立人參皂苷Rg3的含量測定方法，為黑參資源的質(zhì)量控制和開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

萬分之一分析天平(Acculab型，Sartorius group，德國)；十萬分之一分析天平(CP225D型，Sartorius group，德國)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(202-1型，上海陽光實驗儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(jī)(武義縣屹立工具有限公司)；稱量瓶(規(guī)格：40×25)；Agilent 1100 series高效液相色譜儀；KQ-250DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(HH-S型，鞏義市予華儀器有限公司)。

1.2 試藥

人參皂苷Rg3對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110804-200603)；三氯甲烷(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；液相用乙腈、甲醇均為色譜純；水為超純水。

黑參樣品1～14由遼寧中書堂黑參有限公司提供；樣品15為吉林白山地產(chǎn)炮制高麗黑參；樣品16～20為韓國產(chǎn)黑參(樣品信息見表1)。

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取人參皂苷Rg3對照品5.48 mg，用甲醇定容至25 mL容量瓶，配成質(zhì)量濃度為0.219 2 mg·mL-1的對照品儲備液，搖勻，即得，4 ℃下低溫儲藏。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號篩)約1.5 g，精密稱定，加三氯甲烷置索氏提取器中，加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入50 mL具塞錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50 mL，密塞，浸泡2 h，超聲處理30 min，取濾液25 mL，正丁醇飽和氨試液洗3次，每次10 mL，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，定容于5 mL 容量瓶中，過濾，即得[3]。

2.2 色譜條件

色譜柱：Thermo柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；二極管陣列檢測器(DAD)；流動相：乙腈-水梯度洗脫(見表2)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm；檢測時間：40 min；進(jìn)樣量：10 μL。在選定色譜條件下人參皂苷Rg3與相鄰組分分離良好[4]。

表1 黑參樣品信息表

表2 HPLC梯度洗脫條件

注：A.對照品；B.供試品；S.人參皂苷Rg3色譜峰。圖1 對照品及樣品的HPLC圖

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

選取3根不同商品規(guī)格的色譜柱Thermo(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Chiral(150 mm×4.6 mm，5 μm)和Phenomenex(250 mm×4.6 mm，5 μm)，按2.2色譜條件，對照品和樣品各進(jìn)10 μL，根據(jù)報告得出目標(biāo)峰在每根柱子上的分離度、對稱因子、拖尾因子和理論塔板數(shù)等數(shù)據(jù)。

2.4 供試品制備方法考察

供試品1：取本品粉末(過四號篩)1.5 g，精密稱定至50 mL錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，浸泡2 h，超聲處理30 min，取濾液25 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，過濾，待測。

供試品2：取本品粉末(過四號篩)1.5 g，精密稱定，加三氯甲烷置索氏提取器中，加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入50 mL錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50 mL，密塞，浸泡2 h，超聲處理30 min，取濾液25 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，過濾，待測。

供試品3：取本品粉末(過四號篩)1.5 g，精密稱定，加三氯甲烷置索氏提取器中，加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入50 mL錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50 mL，密塞，浸泡2 h，超聲處理30 min，取濾液25 mL，正丁醇飽和氨試液提取3次，每次25 mL，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，定容于5 mL 容量瓶中，過濾，待測。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液(0.219 2 mg·mL-1)6、8、10、12、16、20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，以人參皂苷Rg3進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X(μg)，計算線性回歸方程。

2.5.2 精密度考察 精密稱定樣品1.502 3 g，按樣品制備方法制備供試品，在上述色譜條件下，對同一樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計算各峰面積的RSD。

2.5.3 重復(fù)性考察 按供試品溶液制備方法，制備黑參樣品6份，在上述色譜條件下，對其進(jìn)行含量測定，計算出樣品中人參皂苷Rg3含量，并計算出6份樣品含量的RSD值。

2.5.4 穩(wěn)定性考察 在室溫條件下，精密吸取同一樣品溶液，按樣品測定方法，測定放置0、2、6、8、12 h內(nèi)樣品中人參皂苷Rg3的峰面積，并計算出樣品含量的RSD值。

2.5.5 定量下限的測定 進(jìn)已知濃度的對照品，選出一段基線平穩(wěn)的時間段，測出噪音值，根據(jù)其相應(yīng)的峰高值，將對照品溶液稀釋至10倍信噪比的濃度，重復(fù)進(jìn)樣6次，計算RSD值。

2.5.6 加樣回收率考察 由樣品重復(fù)性測定項，得知樣品中人參皂苷Rg3的含量為1.805 6 mg·g-1。稱取黑參樣品6份，每份0.75 g，精密稱定，精密加入質(zhì)量濃度為0.219 2 mg·mL-1的對照品溶液6.18 mL，揮干樣品，按測定項下方法處理，計算回收率。

2.6 水分的測定

按2015版《中華人民共和國藥典》第四部水分測定法中第二法的操作[5]，測定不同批次黑參的含水量。

2.7 含量測定

按供試品溶液制備項下方法制備樣品液，每份樣品平行做3份。精密吸取樣品液10 μL，注入高效液相色譜儀中，測定人參皂苷Rg3的色譜峰面積，用外標(biāo)法計算不同批次黑參樣品中人參皂苷Rg3的含量。

3 結(jié)果

3.1 色譜柱考察

3根不同的色譜柱對于人參皂苷Rg3的分析符合要求。3根色譜柱所測樣品分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于5000，最小理論塔板數(shù)考察結(jié)果符合有關(guān)規(guī)定。Thermo柱的柱效最大，且拖尾因子0.969符合《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)(0.95～1.05)，所以選擇Thermo柱進(jìn)行含量測定。

3.2 提取方法考察

見表3。

表3 不同提取方法考察

正丁醇提取比甲醇好，正丁醇提取液經(jīng)正丁醇飽和氨試液反洗后，提取液更澄清，且不影響含量，最后選擇供試品3的提取方法。

3.3 方法學(xué)考察

線性回歸方程為Y=385.49X-12.517，r=0.999 2，人參皂苷Rg3在1.315～4.384 μg線型關(guān)系良好；精密度考察中RSD為1.88%，精密度良好；重復(fù)性考察中RSD為2.73%，表明方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性考察中RSD為2.44%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；進(jìn)質(zhì)量濃度為0.876 8×10-2mg·mL-1的對照品，選出一段基線平穩(wěn)的時間段(9～9.5 min)，測出噪音值，則定量下限為0.876 8×10-2；平均加樣回收率99.04%，RSD小于3%，符合有關(guān)規(guī)定。由方法學(xué)考察結(jié)果可知，本實驗方法檢測靈敏度高，檢測結(jié)果可靠。

3.4 黑參中人參皂苷Rg3含量測定

見表4。

以干燥品計算人參皂苷Rg3含量，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)建議黑參中的水分不超過12%；不同批次黑參中人參皂苷Rg3的含量差異明顯，其中人參皂苷Rg3的平均含量(以干燥品計)為1.236 5 mg·g-1，最低為0.368 7 mg·g-1，最高為2.500 7 mg·g-1，相差6.8倍；國產(chǎn)和韓國產(chǎn)黑參中人參皂苷Rg3的平均含量分別為1.515 9、0.398 4 mg·g-1，相比較而言韓國產(chǎn)黑參中人參皂苷Rg3的含量較低，其黑參質(zhì)量較差。

(1)

3.5 黑參中人參皂苷Rg3含量與外觀性狀的相關(guān)性分析

采用SPSS 20.0、Masslynx軟件對數(shù)據(jù)分別進(jìn)行相關(guān)分析，黑參中人參皂苷Rg3含量與黑參外觀各項指標(biāo)無相關(guān)性，P值均大于0.01。

4 討論

本實驗考察了脫脂溶劑及時間，未脫脂和用三氯甲烷脫脂幾乎沒有區(qū)別，皂苷未損失，石油醚脫脂使皂苷峰面積降低，考慮到盡可能除去脂溶性等雜質(zhì)，保護(hù)色譜柱，選擇用三氯甲烷脫脂再提取皂苷，時間為3 h；考察提取方式得到回流和超聲相差不大，與其他研究相比，超聲提取更簡便快速；通過對不同提取溶劑的考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取率依次為乙醇<甲醇<正丁醇，因此最終選擇正丁醇。得到的正丁醇提取液再用氨水反洗是為了中和提取成分中的酸性物質(zhì)，防止酸性環(huán)境使提取藥物中的一些成分改變，也會防止酸性物質(zhì)進(jìn)液相損壞柱子，經(jīng)考察氨水反洗后，皂苷含量不受影響，而且反洗后的提取液更澄清。

由于不同樣品人參皂苷單體含量差別很大，很難評價黑參的質(zhì)量，在保證影響人參藥材品質(zhì)的生長年限及保存條件等因素一致的情況下，造成這種差距的原因可能是與黑參炮制的方法有關(guān)。同時不同批次黑參中人參皂苷Rg3含量與黑參外觀各項指標(biāo)無相關(guān)性，其原因也是黑參炮制過程中的加工方法和溫度等工藝的影響。因此應(yīng)該嚴(yán)格規(guī)范黑參的炮制工藝。黑參的制作需要將鮮人參在蒸參設(shè)備中用蒸汽或其他方法進(jìn)行蒸煮后晾干的過程反復(fù)進(jìn)行9次，其加工流程為：收獲鮮參-清洗-干燥-第一次蒸曝-第二次蒸曝-第三次蒸曝-第四次蒸曝-第五次蒸曝-第六次蒸曝-第七次蒸曝-第八次蒸曝-第九次蒸曝[6]。除此之外，不同黑參樣品中多糖、多酚、游離氨基酸等的含量都具有一定的差距[7]。目前，國內(nèi)外對黑參的質(zhì)量沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這就造成了評價黑參質(zhì)量的困難。因此，建立統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來評價黑參已經(jīng)迫在眉睫。本實驗研究有助于推進(jìn)黑參質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，為黑參的開發(fā)利用提供參考。