金銀花組織培養外植體滅菌方法的研究

韓笑，王娜，張玲，李佳

山東中醫藥大學，山東 濟南 250355

金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb的干燥花蕾或帶初開的花[1]，富含酚酸類、環烯醚萜類、黃酮類、糖類揮發油類及微量元素等多種成分，有抑菌抗炎，抗氧化等多種生理活性，有清熱解毒、治療熱毒血痢、癰疽疔毒的功效[2-3]。由于忍冬繁殖能力強，對土壤和氣候的選擇并不嚴格，全國各地均有種植，且以河南的“密銀花”和山東的“濟銀花”最為出名。目前在大田生產中主要以扦插和分根繁殖為主。由于近年來金銀花價格走勢不斷上升，運用范圍不斷拓寬，藥農對金銀花的關注度更是增高。植物組織培養是指在無菌環境下，利用植物離體的細胞，組織或器官在人工培養的條件下生成新的植物體的過程。組織培養能在較短的時間內繁殖出大量的植株，有快速、高效的作用。同時，對于金銀花等容易攜帶病毒，易于退化的植物來說，組織培養可以保持其親本的優良性狀，維持良好品質[4]。在組織培養過程中，面臨的主要問題之一便是外植體的雜菌感染，如何將外植體進行有效的滅菌，從而得到大批量無菌苗，應用于大田生產，得到量大、價低且品質好的金銀花品種是我們一直努力的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金銀花：采于山東中醫藥大學藥圃，由山東中醫藥大學李佳教授鑒定品種為“金華三號”。

主要試劑：MS干粉培養基，無水乙醇，氯化汞，納米銀(直徑為120 nm)，瓊脂粉，蔗糖，氫氧化鈉，I-BA。

高壓滅菌鍋，超聲波清洗機，PH檢測儀，無菌操作臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理 取金銀花新生幼嫩莖尖2～3 cm長，用清水浸泡清洗10 min后用吸水紙擦干，再用質量分數為1.0%的洗衣粉溶液浸泡20 min后再用清水沖洗30 min，用吸水紙擦干剪掉莖底部變色發黑部分，處理后長約為2 cm莖尖為備用外植體。

1.2.2 樣品滅菌方式 我們選擇滅菌和抑褐效果較好的乙醇和氯化汞為滅菌劑[5]。

1.2.2.1 堿化乙醇處理 將預處理后的外植體正交實驗優選出實驗方案，將乙醇濃度，氫氧化鈉質量分數，處理時間和溫度為影響因素，污染率，褐化率和成活率作為評價標準，采用四因素三水平進行比較。正交實驗因素水平表見表1，正交實驗結果及分析見表2。使用乙醇濃度分別為70%、75%、80%；氫氧化鈉質量分數分別為0.5%、1.0%、1.5%；處理時間分別為20、30、40 s；處理溫度分別為20、25、30 ℃。經優化得到L9(34)的正交試驗。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.2.2 氯化汞處理 使用質量分數為0.1%的氯化汞溶液，處理時間分別為5、6、7、8 min。

1.2.2.3 混合處理 A處理：乙醇濃度75%，氫氧化鈉質量分數為1.0%的堿化乙醇處理30 s+質量分數0.1%氯化汞7 min。

B處理：直接將備用外植體用無菌水沖洗3遍并用無菌吸水紙擦干后接種到1/2 MS+0.7%瓊脂+3.0%蔗糖+0.1%納米銀+3.0 mg·L-1IBA的培養基上。

C處理：將備用外植體用無菌水沖洗3遍并用無菌吸水紙吸凈水分后接種于1/2 MS+0.7%瓊脂+3.0%蔗糖+3.0 mg·L-1IBA銀的培養基上。

每個處理接種20瓶，重復三次。

1.2.3 培養基類型 a型：1/2 MS+0.7%瓊脂+3.0%蔗糖+3.0 mg·L-1IBA[6]

b型：1/2 MS+0.7%瓊脂+3.0%蔗糖+0.1%納米銀+3.0 mg·L-1IBA

培養基pH在5.8～6.0之間。

1.2.4 培養環境 將接種后的外植體置于無菌組織培養室中，溫度25 ℃左右，濕度60%，光照2000 lx，光照時間16 h·d-1。

培養15 d內看污染情況，30 d內看死亡及褐化情況并及時做好記錄。

(1)

(2)

(3)

2 結果與分析

2.1 不同滅菌處理后滅菌效果

2.1.1 堿化乙醇處理效果 由于金銀花外被疏絨毛和疏腺毛，滅菌較為困難。在滅菌劑中加入適量的氫氧化鈉，可增大滅菌劑與金銀花表面的接觸面積，提高滅菌率。

在實驗中我們發現，乙醇濃度低，滅菌時間短都可能造成滅菌不徹底，污染率就相應增高，乙醇濃度過高，滅菌時間增長則使外植體褐化率增高，成活率降低，而氫氧化鈉的濃度過高則過分破壞了金銀花表面，使其褐化率增高。根據表2可知，處理時間的極差值最高為1.314，為四個因素中最重要因素。本實驗中最適處理時間為30 s。實驗五中氫氧化鈉的質量分數為1.0%，處理時間為30 s，乙醇的濃度為75.0%，溫度為25 ℃時外植體污染率和褐化率較低，成活率最高，為最優滅菌方法。

實驗結果=污染率×0.3+褐化率×0.3+成活率×0.4

(4)

表2 堿化乙醇對頂芽滅菌正交實驗安排及結果

通過表3我們可以看出，處理時間對金銀花外植體滅菌處理結果的影響達到極顯著水平，乙醇濃度和氫氧化鈉質量分數對金銀花外植體滅菌處理結果的影響達到顯著水平，溫度對金銀花外植體滅菌處理結果的影響不顯著。

表3 正交設計方差分析表

注：*表示P<0.05。

2.1.2 驗證實驗 最佳方案(實驗5)進行三批實驗驗證，得出實驗結果如表4所示，三次結果同實驗五結果比較變動較小，說明結果穩定。

表4 最佳方案驗證實驗

2.1.3 氯化汞處理效果 氯化汞是滅菌效果較強的滅菌劑，滅菌時所需濃度較低。通過表5我們不難發現，用0.1%的氯化汞處理7 min時，外植體的污染率和褐化率處在一個相對較低的水平，成活率達到88.3%，這一試驗也驗證了文明玲等的研究結果[7]。且通過表2和表5對比，我們發現，0.1%的氯化汞滅菌效果遠遠高于乙醇，且對外植體的破壞較小，成活率更高。

表5 氯化汞對頂芽滅菌效果

2.1.4 混合處理滅菌效果 通過表6我們發現，A處理是將堿化乙醇和氯化汞相結合進行處理，得到的外植體滅菌效果確實有所增加，但褐化率也有一定程度的上升，我們認為，可能是較長時間的試劑處理使外植體外表損壞增大，從而使褐化率增加，成活率有一定的下降。在表六這幾個處理中，不難發現，B處理是效果最好的處理方式，污染率低至1.7%，褐化率為3.3%，成活率高達96.7%。在B處理過程中，我們最小化的降低對外植體的破壞，只將其外帶的細菌病毒等殺滅，然后接種于含有納米銀的培養基上，就達到了較好的效果。將B處理與C處理對照，兩者之間差別為是否含納米銀分子，顯而易見，納米銀在抑制雜菌生長方面有著較為顯著地效果。納米銀是直接通過損傷細菌的細胞壁、細胞膜甚至對細菌的代謝產生影響來達到抑菌的作用。且納米銀具有無耐藥性，無毒無害，廣泛應用于臨床試驗中[8-9]。從C處理中我們也可以發現，破壞較小的外植體褐化率較低，且其污染率及成活率也是有一定的參考之處。因此筆者認為，金銀花外植體含有的成分綠原酸等具有抑菌抗病毒的作用，從而使得金銀花外植體自身產生抵抗外界雜菌病毒的機制，使其污染率到達一個與表2中1號處理幾乎持平的效果。

采用不同濃度，不同質量分數、不同處理時間的堿化乙醇滅菌實驗，找到最優方案再與氯化汞處理相結合達到最優的滅菌結果。

表6 混合處理對頂芽的滅菌效果

3 結論與展望

金銀花外植體滅菌方式多種多樣，外被疏絨毛、疏腺毛等特征，使得滅菌方法與其他植物相比有所不同。試劑處理后最佳滅菌方式為濃度75.0%乙醇與質量分數1.0%氫氧化鈉混合形成堿化乙醇處理30 s加質量分數0.1%氯化汞處理7 min得到污染率5.0%，成活率88.3%的處理方式?？紤]到大田生產的成本問題，0.1%的氯化汞處理7 min則更為合適。同時，本實驗中最優滅菌方法為在含有納米銀的b型培養基上接種經無菌水沖洗干凈的外植體，可以達到98.7%的滅菌率，96.7%的成活率。

隨著科技的發展，試驗水平和儀器設備標準的提升，無菌處理以及組織培養技術將會達到一個更高的水平。