膽南星中膽酸類成分含量測定及發酵前后含量比較△

劉曉峰，崔亞晨，單國順，許枬，高慧

遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600

膽南星為制天南星的細粉與牛、羊或豬膽汁經加工而成，或為生天南星細粉與牛、羊或豬膽汁經發酵加工而成[1]。炮制能緩和天南星燥烈之性，降低毒性，轉變藥性，性由溫轉涼，味由辛轉苦，功能也由溫化寒痰轉為清化熱痰，即所謂相畏為制、生毒熟減、以寒制熱[2]。課題組通過市場及生產企業的走訪調研，了解到因為缺少相應的質控指標，膽南星發酵工藝不規范，發酵時間從24 h至數月不等，所用膽汁多為豬膽汁(或豬膽膏)，膽汁用量相差數倍，產品質量參差不齊，故急需建立膽南星的質控標準，改善膽南星當前所存在的一些問題[3]。

關于膽南星含量測定的方法有一些報道[3-7]，但因炮制機理不清，所選指標未體現出與質量控制的相關性。課題組前期研究發現，膽南星發酵后結合型膽酸轉化為游離型膽酸，如甘胺豬膽酸、牛磺豬膽酸轉化為豬膽酸；甘胺豬去氧膽酸、牛磺豬去氧膽酸轉化為豬去氧膽酸；甘胺鵝去氧膽酸、牛磺鵝去氧膽酸轉化為鵝去氧膽酸。因此足夠的發酵時間和充足膽汁量是幾種游離型膽酸含量的保證，本文建立豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸3個增量成分的含量測定方法，為膽南星發酵原理、工藝規范化研究提供參考。

1 材料

Waters Acquity Arc高效液相色譜儀；奧泰2000蒸發光散射檢測器；KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MettLer AE240型十萬分之一分析天平；HWS-080恒溫恒濕箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

豬去氧膽酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100087-200610，純度97.3%)；鵝去氧膽酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110806-201105，純度99.2%)；豬膽酸(自制，純度99.3%)；甲醇(色譜純，天津市康科德科技有限公司)；乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)；重蒸水；其他試劑為分析純；豬膽購自大連礎明肉聯廠。

東北天南星采自遼寧本溪市，經遼寧省藥品檢驗檢測院王維寧教授鑒定為天南星科植物東北天南星ArisaemaamurenseMaxim.的干燥塊莖，按照《中華人民共和國藥典》中天南星項下檢測方法，測得水分(8.22%)，總灰分(4.5%)，浸出物質量分數(27.78%)，總黃酮質量分數(0.32%)，均符合《中華人民共和國藥典》標準。

自制膽南星樣品：取東北天南星細粉(過五號篩)與豬膽汁(經絹布濾過)約1∶1比例混合，置30～35 ℃，70%～80%的恒溫恒濕培養箱中發酵15～20 d取出，至蒸制容器中蒸1 h至透，趁熱切成1.5～2 cm的小塊，曬至黑褐色，即得。

其余為10批市售商品膽南星樣品見表1。

表1 膽南星樣品信息

2 方法與結果

2.1 混合對照品制備

取豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成質量濃度為0.16、0.19、0.32 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取膽南星粉末(過五號篩)約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入甲醇40 mL，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)50 min，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為Waters C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.5%冰乙酸溶液(60∶40)；流速：1.0 mL·min-1；漂移管溫度：105 ℃；氣體流速：3.0 L·min-1；柱溫為30 ℃；對照品進樣體積為5、20 μL；樣品進樣量為5 μL，按上述條件進行測定。色譜圖見圖1。

注：A.膽酸混合對照品；B.自制膽南星樣品；1.豬膽酸；2.豬去氧膽酸；3.鵝去氧膽酸。圖1 膽酸混合對照品自制膽南星樣品色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系的考察 用移液器分別精密吸取2.1項下混合對照品溶液0.2、0.3、1、2、6、8 mL，置于10 mL量瓶中，色譜甲醇稀釋至刻度，搖勻，得6個系列濃度的混合對照品溶液。在2.3色譜條件下分別進樣10 μL，以各成分的進樣量(μg)的對數為橫坐標(X)，色譜峰面積的對數為縱坐標(Y)，得回歸方程：豬膽酸為Y=1.550 4X+6.059 0，r=0.999，結果表明，豬膽酸對照品進樣量在0.032～1.28 μg線性關系良好。豬去氧膽酸為Y=1.449 3X+5.356，r=0.999，結果表明，豬去氧膽酸對照品進樣量在0.038～1.52 μg線性關系良好。鵝去氧膽酸為Y=1.614 6X+5.660 3，r=0.999，結果表明，鵝去氧膽酸對照品進樣量在0.064～2.56 μg線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗 吸取同一供試品溶液5 μL，連續進樣6次，測定峰面積，RSD值分別為0.86%、1.4%、0.9%，表明精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 吸取同一供試品5 μL，在0～24 h內進樣，測定峰面積，RSD值分別為2.15%、1.90%、2.10%，結果表明，樣品溶液在所考察時間內穩定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批供試品(自制膽南星)，精密稱取6份，按同樣方法操作，測得豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的平均質量分數分別為2.212 0、8.413 3、9.104 2 mg·g-1，RSD值分別為2.60%、2.20%、2.80%，結果表明，該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取同一批供試品(自制膽南星)，精密稱取6份，每份約0.25 g，精密稱定，至25 mL容量瓶，分別精密加入豬膽酸對照品溶液(0.660 6 mg·mL-1，純度99.3%)1.0 mL、豬去氧膽酸(1.105 4 mg·mL-1，純度97.3%)1.8 mL、鵝去氧膽酸(0.488 9 mg·mL-1，純度99.2%)5 mL及甲醇溶液12 mL，超聲處理(功率200 W，頻率40 KHz)50 min，放至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。測定加標樣品中的豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量，結果見表2～4。

2.4.6 耐用性試驗 吸取同一供試品溶液5 μL，按同法操作，分別考察了不同柱溫(25、30、35 ℃)、不同流動相比例(乙腈占比50%、55%、60%)以及不同品牌色譜柱(waters和Ecosil)，結果豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸色譜峰與其他組分可得到基線分離，表明該方法耐用性良好，見色譜圖2～4。

表2 豬膽酸回收率試驗結果(n=6)

表3 豬去氧膽酸回收率試驗結果(n=6)

表4 鵝去氧膽酸回收率試驗結果(n=6)

注：A.25 ℃；B.30 ℃；C.35 ℃。圖2 膽南星不同檢測柱溫色譜圖

注：A.乙腈占比50%；B.乙腈占比55%；C.乙腈占比60%。圖3 膽南星不同流動相比例檢測色譜圖

A.Waters C18色譜柱；B.Ecosil C18色譜柱。圖4 膽南星不同色譜柱檢測色譜圖

2.4.7 檢測限 應用《中華人民共和國藥典》第四部檢測限中方法1直觀法可知，豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的檢測限分別為0.037 6、0.044、0.040 μg，所建立含量測定方法符合檢測限要求。

2.4.7 樣品含量測定 取膽南星樣品，精密吸取對照品溶液，按同樣項下方法操作，測得豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的含量。

表5 膽南星樣品含量測定結果 mg·g-1

注：“—”表示未檢測到。

3 討論

3.1 膽酸類含量測定方法的建立

本實驗考察了不同提取時間(20、30、40、50、60 min)，不同流動相比例(乙腈占比50%、55%和60%)，不同柱溫(25、30、35 ℃)以及不同品牌色譜柱(waters和Ecosil)對于膽南星不同樣品膽酸類成分的影響。結果表明，提取50 min時豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸樣品提取含量基本穩定且含量較高。乙腈占比50%、55%和60%均能使豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸色譜峰與其他組分可得到基線分離，為節省時間，本實驗選擇乙腈占比60%進行。柱溫考察時，綜合待測物峰面積及對色譜柱的影響，最終選擇柱溫為30 ℃。本法操作簡單，所選指標與膽南星質量密切相關，可用于膽南星發酵工藝及質量的評價。

3.2 膽南星含量檢測結果分析

在調研中了解到，部分廠家存在發酵時間短(24 h)、膽汁加入量差異較大等問題。調研結果與本實驗結果相符，即不同廠家的膽南星樣品中幾種膽酸類成分含量相差較大，部分樣品未檢測到游離型膽酸類成分(結合型膽酸未轉化或轉化不完全，以致游離型膽酸含量過低)。由此可見，本研究建立的游離型膽酸含量測定的方法能夠反映發酵周期、膽汁加入量，可以評價膽南星的質量。

3.3 膽南星炮制原理研究

膽南星發酵工藝不規范、缺少科學有效的控制指標等問題，均源于膽南星的發酵機理不清楚。為此，課題組前期做了天南星、膽南星的多成分對比，包括膽酸類成分、總黃酮、總糖、夏佛托苷、腺苷等核苷類成分[8]，其中膽南星發酵前后膽酸類成分有明顯的變化規律，即發酵后結合型膽酸轉變為游離型膽酸，且游離型膽酸的含量與發酵時間、膽汁加入量密切相關，可用于膽南星的質量控制。

本文以幾種增量的游離型膽酸成分為檢測指標，建立高效液相-蒸發光散射檢測器(HPLC-ELSD)的含量測定方法，可為膽南星發酵工藝的規范化、膽南星質量的控制等提供依據。在今后的研究中，將對天南星中成分(如總黃酮、糖類)在發酵前后的變化予以關注，以期更好地闡釋膽南星的發酵原理。