核桃楸葉降血糖和抗氧化有效部位的篩選及其成分分析△

王會，劉匯，張楠茜，張輝*，高文義*，孫佳明

1.長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2.吉林省延邊朝鮮族自治州食品藥品檢驗所，吉林 延吉 133000

核桃楸葉是胡桃科胡桃屬植物核桃楸JuglansMandshuricaMaxim.的樹葉。原植物核桃楸，又名胡桃楸[1]，落葉喬木，生長在中國東北、華北、河北等地區[2-3]，其青果皮、莖、葉和樹皮均可入藥[4]。糖尿病是近年來發病率迅速增加并嚴重危害人類健康的疾病之一，糖尿病分為1型糖尿病和2型糖尿病，后者是最常見的，占糖尿病患者的90%以上[5-6]。α-葡萄糖苷酶抑制劑對餐后高血糖和高胰島素血癥有良好的防治效果，用于治療由碳水化合物代謝紊亂而引起的疾病；α-淀粉酶抑制劑對唾液淀粉酶和胰液淀粉酶活性具有良好的抑制作用，阻礙食物中碳水化合物的代謝，降低體內的血糖和血脂水平，防止餐后高血糖[7-8]。

近年來對核桃楸其他部位的研究報道較多，但是對核桃楸葉的研究報道較少。本文建立了α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶體外抑制和DPPH自由基清除模型[9-10]，用于研究核桃楸葉乙醇提取物不同極性萃取部位對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制作用和DPPH自由基清除活性，并采用紫外分光光度法測定總黃酮含量，篩選核桃楸葉降血糖和抗氧化有效部位，超高效液相色譜法(UPLC)分析確定其活性成分，為研究其藥理作用奠定基礎，對核桃楸葉的開發和應用具有指導意義[11]。

1 材料

1.1 藥材

核桃楸葉藥材采于吉林省通化市，由長春中醫藥大學張輝教授鑒定為核桃楸JuglansmandshuricaMaxim.的干燥葉。

1.2 試劑與儀器

α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、維生素E、阿卡波糖(Sigma，美國)，對硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(PNPG，Sigma，美國)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，Sigma，美國)；維生素C(Sigma，美國)；對照品蘆丁(純度≥98%)、金絲桃苷(純度93.3%)、異槲皮素(純度≥98%)和紫云英苷(純度>99%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；其余試劑均為分析純。Agilent 1260 Infinity(美國安捷倫公司)；BP211D型十萬分之一電子天平(賽多利斯儀器有限公司)；酶標儀(Bio-Rad)；KQ3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(Varian公司)；DSHZ-300A型旋轉式恒溫振蕩器(太倉市實驗設備廠)；96孔板；各種型號移液槍及槍頭等。

2 方法與結果

2.1 核桃楸葉各部位的提取與分離

稱取適量的核桃楸葉，置于圓底燒瓶中，先用90%的乙醇水溶液回流提取1次，再用70%的乙醇水溶液回流提取2次，料液比均為1∶10，每次1 h，濾過，合并提取液。回收乙醇，減壓濃縮。取500 mL核桃楸葉乙醇提取液，揮至無醇味，剩余350 mL，取100 mL留為總提(A)，剩余的250 mL依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，獲得不同溶劑萃取部位，依次標記為B、C、D，萃取后溶液作為水層(E)，萃取方法為等體積萃取3次。收集各層萃取液，減壓濃縮、干燥至干膏，作為供試藥物[12]。

2.2 測定核桃楸葉不同萃取部位(A～E)對α-葡萄糖苷酶抑制活性

根據已有方法改進[13-14]，檢測在96孔板上進行，先加入20 μL不同濃度樣品，再加入40 μL 0.5 U·mL-1的α-葡萄糖苷酶，37 ℃恒溫振蕩孵育5 min；加入20 μL 3 mmol·L-1的底物PNPG，37 ℃恒溫振蕩孵育15 min，最后加入100 μL 0.1 mol·L-1Na2CO3，立即測定405 nm處的吸光度(A)值[15]。每個濃度樣品同時進行3個平行測定并取平均值。實驗均設定空白對照、背景對照、陰性對照，按公式(1)計算抑制率，并計算相應的IC50值，A～E的α-葡萄糖苷酶抑制活性如表1所示。

(1)

2.3 測定A～E對α-淀粉酶抑制活性

應用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定α-淀粉酶活性[17]，反應體系為0.2 mL的α-淀粉酶溶液，在37 ℃下預熱5 min后，加入0.4 mL淀粉溶液和0.2 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在37 ℃下反應30 min。反應完成后加入2 mL DNS，在沸水中反應10 min，取出，冷卻，取0.5 mL反應溶液置于5 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，用紫外可見分光光度計測定540 nm處的A值，實驗均設有樣品、背景對照、空白和空白對照。按公式(2)計算抑制率，并計算相應的IC50值。反應體系見表2，抑制率結果見表3。

(2)

表2 A～E對α-淀粉酶活性反應體系

注：—表示用同體積蒸餾水代替。

表3 A～E對α-淀粉酶抑制活性

2.4 測定A～E對DPPH自由基清除活性

采用DPPH法[17-18]對分離得到的核桃楸葉乙醇提取物進行體外抗氧化活性評價。精密量取2 mL質量濃度為26.4 mg·L-1的DPPH甲醇溶液，再分別加入2 mL不同濃度的用甲醇溶液制備的樣品液，混合均勻，避光條件下反應30 min，測定其在517 nm處的A值[15，19]。同時，用2 mL甲醇溶液代替樣品溶液作為空白對照，將2 mL樣品溶液與2 mL甲醇溶液混合作為樣品對照，將維生素E作為陽性對照，按公式(3)計算樣品液對DPPH溶液清除率。

(3)

式中：Ai為與待測溶液混合后的DPPH溶液的吸光度；Aj為與待測溶液混后的溶劑的吸光度；A0為溶劑和DPPH溶液混后的吸光度。

A～E的DPPH清除率如表4所示，結果可知，C的清除率遠高于其他4個部位，因此，C對DPPH自由基清除活性最好，表明C是核桃楸葉抗氧化的有效部位。

表4 A～E的DPPH自由基清除活性

2.5 A～E的總黃酮含量測定

運用紫外分光光度法[20]，精密稱取11.5 mg(于105 ℃干燥至恒重的)蘆丁對照品，置于50 mL容量瓶中，先加入適量60%乙醇水溶液超聲溶解，再用適量的60%乙醇水溶液稀釋定容，制得蘆丁對照品溶液(0.20 mg·mL-1)。精密吸取上述蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加入0.4 mL 5% NaNO2溶液，混合均勻，靜置6 min，加入0.4 mL 10% Al(NO3)3溶液，混合均勻，靜置6 min，加入4.0 mL 4% NaOH溶液，最后用50%乙醇水溶液稀釋至刻度，混合均勻，靜置15 min[21]。將50%乙醇水溶液作為空白對照，運用紫外分光光度法，測定512 nm處不同質量濃度蘆丁對照品溶液的A值。以A值為縱坐標(Y)，以蘆丁對照品溶液的質量濃度為橫坐標(X)進行線性回歸，制備標準曲線，得回歸方程為Y=0.654 3X-0.061 1(r=0.999 5，n=3)，結果表明，蘆丁質量濃度在0.23～1.15 mg·mL-1呈良好的線性關系。

吸取適量的A～E樣品液置于不同的容量瓶中，依上述方法，測定其512 nm處的A值，將不加供試品的樣品作為空白。結合標準曲線計算供試品中總黃酮的含量，結果如表5所示。

表5 A～E的總黃酮含量測定結果

2.6 UPLC分析

分析條件：Agilent SB-C18色譜柱(4.6 mm×100 mm，1.8 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min：5%～20% A；10～40 min：20%～23% A；40～45 min：23%～25% A；45～70 min：25%～25% A；70～75 min：25%～100%A；75～95 min：100%～100% A)。流速為300 μL·min-1，檢測波長為254 nm，柱溫為25 ℃，溶液均為1 mg·mL-1。混合標準品進樣體積為5 μL，乙酸乙酯樣品進樣體積為13 μL。色譜圖顯示有3個黃酮類成分的標準品與樣品對應峰的保留時間一致，表明樣品中存在金絲桃苷、異槲皮素和紫云英苷(見圖1)。

注：A.對照品；B.核桃楸葉乙酸乙酯樣品；1.金絲桃苷；2.異槲皮素；3.紫云英苷。圖1 核桃楸葉及對照品HPLC圖

3 討論

核桃楸葉乙醇提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有一定的抑制作用，對DPPH具有清除作用，但沒有具體深入的研究報道。因此，通過建立α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的體外抑制模型，測定DPPH自由基清除活性和總黃酮含量，進行UPLC分析，篩選核桃楸葉的降血糖和抗氧化的有效部位及活性物質。對核桃楸葉各部位進行α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的體外抑制活性以及DPPH清除活性的實驗，結果表明核桃楸葉乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位在體外對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有明顯的抑制作用，其IC50分別為0.014、0.13 mg·mL-1，而陽性藥阿卡波糖的IC50分別為0.044、0.158 mg·mL-1，其對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用均強于陽性藥阿卡波糖；其乙酸乙酯萃取部位比其他萃取部位具有更明顯的DPPH自由基清除能力，其IC50為6.89 mg·mL-1，應該是核桃楸葉的降血糖和抗氧化有效部位；乙酸乙酯活性部位中總黃酮質量分數為86.11%，是該部位的主要成分，其有效成分是金絲桃苷、異槲皮素和紫云英苷。通過本實驗，可以初步確定該活性部位中主要活性物質為黃酮類化合物，且主要活性成分是金絲桃苷、異槲皮素和紫云英苷。該研究為進一步研究核桃楸葉的藥理作用打下堅實基礎，也為深入研究核桃楸葉的應用價值提供理論支持。