一例豬圓環病毒3型引起母豬流產病例的診斷和分析

劉 磊，盧冰霞，陳忠偉，秦毅斌，段群棚，周英寧，何 穎，李 斌，梁家幸，閉炳芬，蔣冬福，盧敬專，楊思儀，蘇乾蓮，趙 武

（廣西獸醫研究所/廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001）

2015年6月，美國北卡羅來納州一規模化豬場暴發PDNS（豬皮炎腎病綜合征）疫情。Palinski等[1]借助新一代測序（NGS）技術，從發病母豬及流產胎兒體內首次鑒定出PCV3。隨后包括美國、韓國、意大利、巴西以及中國的華南、華中和華北多省市都有PCV3流行的報道。PCV3感染可引起豬的皮炎腎病綜合征、種豬繁殖障礙及包括心血管系統、呼吸系統、免疫系統等多系統的炎癥反應，給全世界的生豬養殖造成了很大的經濟損失。作為一種新動物病原體，PCV3對豬的致病性、其在圓環病毒相關疾病中的作用以及其與其他病原的混合感染及互相作用機制還有待進一步研究。

2018年11月28日，廣西一存欄1 000頭母豬場突然出現懷孕后期母豬流產，每天2～5頭母豬流產。母豬流產前不食，體溫正常，流產后很快恢復采食。12月3日豬場將其中2窩流產胎兒送往廣西獸醫研究所病毒研究室進行檢測，剖檢發現胎兒腦充血、肺臟充血出血、腎臟有針尖大的出血點、全身多處淋巴結腫大。實驗室檢測結果表明，PCV3感染可能是引起本次母豬流產的主要原因。現將該病例的檢測報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料

流產胎兒2窩，每窩3頭，共6頭，由廣西某豬場送往本實驗室進行病原檢測。

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產品；2xF8 Fastlong PCR MasterMix為北京艾德萊生物科技公司產品；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）為北京陸橋公司產品；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒為康為世紀公司產品；DL 2 000 DNA Marker為Takala公司產品。

1.3 引物設計與合成

參考文獻[2]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成PCV3檢測引物，PCR擴增核苷酸預期為649 bp。引物序列：P1：5'-TTTTCACTTAGAGAACGGACTTG-3'；P2：5'-AAATGAGACACAGAGCTATATTCAG-3'。

1.4 細菌分離

用無菌接種環采取流產胎兒腦、腎臟、脾臟和肺臟接種到TSA平板培養基上，放在37℃恒溫箱中培養24 h后，看是否有細菌生長。

1.5 病毒檢測

1.5.1 病料處理 每窩流產胎兒（3頭）混為一份進行處理，無菌條件下采取流產胎兒的腦、肝臟、肺臟和脾臟等部位按照1∶3添加滅菌的PBS溶液，用勻漿器進行研磨；懸液反復凍融3次；12 000 r/min離心5 min，取上清液用于下一步DNA/RNA的提取。

1.5.2 DNA/RNA的提取 處理好的組織病料按照AxyPrep Body Fluid Viral RNA/DNA Miniprep Kit使用說明書進行DNA/RNA提取，所獲得的DNA用于下一步的PCR反應或置于-80℃保存，備用；所獲得的RNA用于下一步的RT-PCR，或置于-80℃保存，備用。

1.5.3 PCR/RT-PCR檢測 通過PCR/RT-PCR的方法檢測流產胎兒腦及內臟組織樣品中是否有CSFV（豬瘟病毒）、PRRSV（豬藍耳病病毒）、JEV（豬乙腦病毒）、PRV（豬偽狂犬病病毒）、PPV（豬細小病毒）、PCV2（圓環病毒2型）和PCV3等這些可能引起母豬流產的病毒存在。參考羅廷榮等[3]建立的CSFV RT-PCR檢測方法對組織樣品進行檢測，目的片段大小為478 bp；參考韋瑩等[4]建立的PRRSV RT-PCR檢測方法對組織樣品進行檢測，目的片段大小為443 bp；參考李茂寧等[5]建立的JEV RT-PCR檢測方法對組織樣品進行檢測，目的片段大小為228 bp；參考周復春[6]建立的PRV PCR檢測方法對組織樣品進行檢測，目的片段大小為217 bp；參考于新友等[7]建立的PPV PCR檢測方法對組織樣品進行檢測，目的片段大小為475 bp；參考李瑩瑩[8]建立的PCV2 PCR檢測方法對組織樣品進行檢測，目的片段大小為1 154 bp；參考賀會利等[2]建立的PCV3對樣品進行檢測，目的片段大小為649 bp。

2 結果

2.1 細菌分離結果

在TSA培養基上未有任何菌落生長。

2.2 組織樣品PCR/RT-PCR檢測結果

組織樣品PCR/RT-PCR檢測結果顯示，送檢的2窩流產胎兒 CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PPV、PCV2 均為陰性，而PCV3均為陽性，結果見圖1、圖2。將該PCV3陽性PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI里進行Blast，結果顯示測序所得核苷酸序列與NCBI上登錄的其他PCV3同源性在97.8%～99.7%之間，表明該流產胎兒感染PCV3。

圖1 流產胎兒組織樣品PCR/RT-PCR檢測結果

圖2 流產胎兒組織樣品PCR/RT-PCR檢測結果

3 分析與小結

在養豬生產中能夠引起妊娠母豬流產的原因有很多，營養原因、機械損傷原因、應激原因、疾病原因以及不合理的用藥等都可能造成妊娠母豬流產。2018年11月底廣西某豬場連續數日出現多頭妊娠后期母豬流產現象。養豬場在出現流產前的1周內懷孕母豬未進行過疫苗免疫和群體用藥，母豬群也未表現出外陰紅腫、脫肛等霉菌毒素中毒的現象，豬群在出現流產前也未受到大的應激。在排除霉菌毒素中毒、用藥不當和管理不當造成的應激等可能的原因后，懷疑是疾病因素造成的妊娠母豬流產。2018年12月3日豬場將流產胎兒送本實驗室進行病原檢測。

隨著PCV3在國內外不同地區流行的報道，其致病性也越來越受到更多學者的關注。2017年6月Faccini等[9]收集了意大利不同地區豬群中共計16份流產胎兒或死胎組織，流產胎兒和死胎的腦、淋巴、心臟等組織內均檢測出PCV3，病毒滴度為 1×109～1×1010copies/g，而其他相關病原體檢測結果均為陰性，表明PCV3可能與繁殖障礙相關。同年8月，Tochetto等[10]從巴西一農場出現繁殖障礙的母豬血清內檢測到了PCV3并進行了全基因的擴增，而從同一農場正常生產的母豬血清中未檢測到PCV3，結果也提示PCV3可能與該農場的母豬繁殖障礙有關。為了解引起廣西某規模化豬場母豬流產的病因，本實驗室采用細菌分離培養方法進行細菌分離鑒定；采用PCR/RT-PCR方法檢測可能與母豬流產相關的病毒如CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PPV、PCV2和 PCV3。結果在流產胎兒內臟組織中未分離到細菌；2份流產胎兒的內臟組織中都檢測到PCV3，而其他病原均為陰性，提示PCV3感染可能是引起本次母豬流產的主要原因，提示PCV3也是導致母豬流產的重要病原，應引起業界的警惕重視，并加以防范這一新發疫病。