竹柏內(nèi)生菌的分離篩選及DYSL5、LR5 16SrDNA的擴(kuò)增①

田小芳

（海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院 海南海口 570228）

竹柏［Podocarpus nagi （Thun.）Zol.let.Mor.］，為羅漢松科竹柏屬常綠喬木，別名糖雞子、羅漢柴、椰樹、山杉、鐵甲樹等，屬裸子植物類。廣泛分布于浙江、福建、江西、湖南、廣東、廣西、海南和四川等地［1］。

竹柏在我國南方有大量栽培，但多作為觀賞的園庭、園林樹種，在醫(yī)藥上的研究應(yīng)用并不多見［1］。據(jù)報(bào)道，竹柏的根、莖、葉以及種子含有多種化學(xué)成分，僅從竹柏葉的精油中就分離出37種化學(xué)成分。竹柏中的二萜類化合物具有很強(qiáng)的抗氧化活性，能抑制Fe（III）-ADP/NADPH 引起的微粒脂質(zhì)體氧化和線粒體過氧化，以及亞油酸的自動氧化等作用。竹柏中的竹柏內(nèi)酯A、B 具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，有治療腫瘤的功效。竹柏內(nèi)酯C、D、F對真菌有抑制作用［2］。可見，竹柏有較好的研究和開發(fā)前景。

植物內(nèi)生菌（Plant Endophyte）是指那些在生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的微生物，被感染的宿主植物（至少暫時(shí)）不表現(xiàn)出外在病癥。可從經(jīng)過嚴(yán)格表面消毒的植物組織或植物組織內(nèi)部分離得到［3］。

植物內(nèi)生菌的種類、分布、定植都因植物種類不同而異，包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌，目前研究的植物已達(dá)上百種［4］。盡管內(nèi)生菌在植物體中的生物量微不足道，但現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌對宿主植物至少有以下幾方面的作用：固氮、促進(jìn)植物生長、抗逆境、抗動物攝食、抗病原菌以及他感等［5］。在植物體內(nèi)有穩(wěn)定的生存空間，一旦進(jìn)入植物體內(nèi)，即可獨(dú)立繁殖和傳遞，并占據(jù)有利的生態(tài)位點(diǎn)來防止病原菌的入侵。植物內(nèi)生菌（Plant Endophyte）一詞于1866 年由DeBary 提出，之后在1993 年美國蒙大拿州立大學(xué)的Stierle 等從短葉紅豆杉（Taxus Nutt）的韌皮部中分離到一株產(chǎn)抗癌物質(zhì)紫杉醇（Taxol）的內(nèi)生真菌（Taxomyces andreanae），掀起了藥用植物內(nèi)生菌的研究熱潮［6］。

因此，通過傳統(tǒng)的表面消毒的方法對竹柏葉進(jìn)行內(nèi)生菌的分離，采用對峙培養(yǎng)及對峙劃線法獲得菌株進(jìn)行皿內(nèi)拮抗活性篩選，對高拮抗菌株進(jìn)行16sRrDNA 的擴(kuò)增，為內(nèi)生菌的研發(fā)尋找新型菌落代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物采集

竹柏采自于海南大學(xué)儋州校區(qū)。

1.1.2 供試植物病原指示菌

灰斑病菌、棒孢病菌、西瓜枯萎病菌、芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、芒果蒂腐病菌、水稻紋枯病菌。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

細(xì)菌（LB）培養(yǎng)基： 1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母膏，蒸餾水100 mL，121℃蒸汽滅菌20 min。真菌（CM）培養(yǎng)基：1%蛋白胨，1%酵母膏，2%蔗糖（葡萄糖），1.5%～2%瓊脂，蒸餾水100 mL，加抗生素鏈霉素（不能高溫滅菌）100 μg/ mL。PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖（蔗糖）20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺、全自動高壓濕熱滅菌鍋、電子天平、研缽、電磁爐、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、紫外儀、離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)試劑

無菌水、酒精、0.1% HgCl2、TAE、試劑盒OMEGA D3350-01Bacterial DNA Kit（50）。

1.2 方法

1.2.1 竹柏內(nèi)生菌的分離、篩選及保種

1.2.1.1 竹柏內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)

將采集來的新鮮植物的葉片在自來水下沖洗，洗去表面的泥和灰塵，室內(nèi)晾干后進(jìn)行常規(guī)組織表面消毒。表面消毒處理：在無菌的條件下操作，將少許葉片放入含有70%乙醇的燒杯中浸泡1 min，之后用滅菌過的鑷子將葉片夾出用無菌水淋洗2～3 次，再將葉片放入含有0.1%的HgCl2中，浸泡1 min，取出用無菌水洗4～5 次，洗好之后用滅菌過的剪刀剪小放入滅菌好的研缽中，并向其中加入5 mL 的無菌水充分研磨制成組織懸浮液，之后用移液槍吸取200 μL 的上清液涂布在滅菌過的LB 培養(yǎng)基和加有鏈霉素抑制細(xì)菌的CM 培養(yǎng)基中，并在每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入4～5個(gè)滅菌過的玻璃珠前后搖晃將其上清液均勻的涂布在平板中，用封口膜封好平板，將以上平板放入28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～7 d。

試驗(yàn)設(shè)一個(gè)空白對照，將表面消毒最后一次無菌水涂抹于供試的LB 培養(yǎng)基和CM 培養(yǎng)基上，同樣的培養(yǎng)條件和時(shí)間，觀察是否有菌長出。如果空白對照中有菌長出，則試驗(yàn)視為失敗，重新分離。

1.2.1.2 拮抗細(xì)菌的篩選

從保種管中接出內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行平板劃線擴(kuò)大培養(yǎng)以備用，同時(shí)也從試管斜面中接出病原菌（靶標(biāo)菌）放入PDA培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)以備用。

為了測定內(nèi)生菌對病原菌的抑制活性，采用對峙培養(yǎng)法對分離得到的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行拮抗活性篩選，用滅菌過的打孔器打取培養(yǎng)好的病原菌放于配制好及滅菌過的PDA培養(yǎng)基平板中央，用接種環(huán)挑取純化好的內(nèi)生菌種劃在距平板中央左右對稱的兩側(cè)，封好平板將其放在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～7 d，觀察抑菌的長勢和形狀，一個(gè)供試植物病原指示菌設(shè)2個(gè)重復(fù)。選出對病原菌生長有抑制作用的菌株。

1.2.1.3 拮抗內(nèi)生細(xì)菌的保種

在空白對照沒長出菌的情況下，對內(nèi)生菌進(jìn)行分離與篩選，采用多次劃線法挑單菌落接種到液體培養(yǎng)基中，放入28℃的搖床培養(yǎng)24 h。準(zhǔn)備好滅過菌的40%甘油，取700 μL 甘油和700 μL 菌液先后加入1.5 mL 的保種管中，放入-20℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 對DYSL5和LR5 16SrDNA的擴(kuò)增

1.2.2.1 拮抗菌的活化

將具有高抗性的內(nèi)生細(xì)菌從保菌管中接種到LB 培養(yǎng)基上，采用三線劃線法分離得到單菌落，用接種環(huán)將單菌落接種到試管液體培養(yǎng)基中，放到28℃的搖床中過夜培養(yǎng)。

1.2.2.2 拮抗菌DNA的提取

基因組DNA 提取采用的試劑盒為OMEGA D3350-01Bacterial DNA Kit（50），其方法如下：

從搖床中取出培養(yǎng)好的LB液體拮抗菌株懸浮液，倒入1.5 mL 的微型管中，收集不超過3 mL 的菌液，放入離心機(jī)4 000×g，室溫下離心10 min。倒掉上清液加入180 μL 的ddH2O ，再加20 μL，50 mg/mL lysozyme solution，充分混勻后，放入水溫為30℃的水浴鍋10 min。取出后放入離心機(jī)5 000×g，在室溫下離心5 min。倒掉上清液加入200 μL Buffer BTL，充分混勻。加入25 μL Proteinase K solution ，充分混合后，放入水溫為55℃的水浴鍋水浴不超過1 h，并且每20 min 搖晃一下。水浴完成后加入220 μL Buffer BDL，混勻，65℃水浴10 min。加入220 μL 無水乙醇，輕晃20 s。將DNA迷你管放入收集管中，再將1.5 mL 微型管中的液體用槍頭移入DNA迷你管中。放入離心機(jī)10 000×g，在室溫下離心1 min。倒掉收集管中的液體，再往DNA 迷你管中加入500 μL Buffer HB，離心10 000×g，1 min，倒掉收集管中的液體。往DNA迷你管中加入700 μL DNA Wash Buffer l 離心10 000×g，1 min，倒掉收集管中的液體，再重復(fù)此步驟一次。將倒掉液體的管放入離心機(jī)，＞10 000×g，2 min，以甩干迷你管。將DNA 迷你管放入1.5 mL 的微型管中，往迷你管中加入100 μL 事先放入65℃水浴鍋預(yù)熱的Elution Buffer ，混勻在室溫下靜放3～5 min。放入離心機(jī)10 000×g，1 min，再將微型管中的液體重新移入DNA 迷你管中，再離心一次，將DNA 迷你管丟棄，將1.5 mL 微型管中的DNA液體放入4℃冰箱保存。

1.2.2.3 PCR反應(yīng)

引物。Primer1：5＇-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3＇，Primer2：5＇-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。

以上述得到的DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：模板DNA 1 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL；dNTPs 2 μL； Primer1 （10 μmol/L） 0.5 μL；Primer2（10 μmol/L） 0.5 μL；Ex-Taq 0.25 μL；加入ddH2O至總體積25 μL。

充分混勻后，置于PCR擴(kuò)增儀中，按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；60℃復(fù)性30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸45s；72℃延伸10 min。

1.2.2.4 PCR產(chǎn)物的回收

用試劑盒法進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收，所用試劑盒為OMEGA D3350-01Bacterial DNA Kit（50）。

將所有PCR 產(chǎn)物加入loading buffer 點(diǎn)樣到瓊脂糖凝膠的孔中，跑電泳，然后用干凈、鋒利的手術(shù)刀切割下目的DNA片段的瓊脂塊，稱量重量。

（1）取含DNA片段的瓊脂糖凝膠（100～300 mg），加入同等溶膠質(zhì)量的Binding Buffer（XP2）。

（2）50℃水浴7 min，膠完全融化即可。

（3）將上一步所得的溶液都加入到一個(gè)HiBind DNA 迷你吸附柱中（吸附柱放入收集管中）。10 000×g離心1 min。倒掉液體。

（4）將吸附柱放到同一個(gè)收集管中，加入300μL Binding Buffer（XP2）于吸附柱中，10 000×g離心1 min。倒掉液體。

（5）向吸附柱中加入700 μL 加過無水乙醇的SPW Wash Buffer，清洗吸附柱，10 000×g離心1 min，倒掉廢液。重復(fù)一次。

（6）將吸附柱放回收集管中，13 000×g 離心2 min，甩干剩余液體，倒掉廢液。

（7）將離心柱置于新的離心管中，加入30μL的Elution Buffer，13 000 r/min離心1 min。將溶液收集到離心管中。

1.2.2.5 連接 于0.2 mL 離心管中配置試劑：加入3 μL 的ddH2O，然后加入1 μL 的模版，1 μL 載體，充分混勻后放入PCR擴(kuò)增儀，25℃連接15 min，4℃放置30 min。

1.2.2.6 轉(zhuǎn)化

從-80℃冰箱中取出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10，冰上融化，加入連接產(chǎn)物5 μL于50 μLTrans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈幾下，冰浴20 min，42℃恒溫水浴熱激30 s，立即置于冰上冷卻2 min，加入250μL平衡至室溫的soc/LB，置于37℃，200 r/min的搖床上培養(yǎng)1 h，取80 μL，500 mmol/L IPTG，40 μL，20 mg/mL X-gal 混合均勻，涂布于準(zhǔn)備好的LB 培養(yǎng)基上（含Amp），在37℃正放置30 min。待前兩種物質(zhì)被吸收后，取200 μL 菌液涂板，干燥后放37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌分離結(jié)果

運(yùn)用常規(guī)組織分離方法及涂抹對采集的竹柏葉進(jìn)行內(nèi)生菌分離，經(jīng)過2～5 d 的培養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)空白對照處理有菌落長出，表明組織表面消毒徹底，因此可以認(rèn)為獲得菌株為植物的內(nèi)生菌株，分離得到ZB（1、2、3、4、5、6） 6株內(nèi)生細(xì)菌。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌對靶標(biāo)菌的拮抗作用測定結(jié)果

采用皿內(nèi)培養(yǎng)法將8株供試植物病原指示菌分別對ZB（1、2、3、4、5、6）6 株菌株進(jìn)行對峙試驗(yàn)培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果如表1。

從表1 中可以看出，ZB（2、3、4、6）對各病原菌有一定的抑制效果，其中ZB2對香蕉炭疽病菌抑制效果最明顯，拮抗菌株篩選結(jié)果見圖1～6。

表1 內(nèi)生細(xì)菌對8株供試植物病原指示菌的皿內(nèi)拮抗作用測定結(jié)果

圖1 ZB2和ZB6對香蕉炭疽病菌的抑制

圖2 ZB2對灰斑病菌的抑制

圖3 ZB2、3和4對香蕉枯萎病菌的抑制

圖4 ZB3和ZB4對棒孢病菌的抑制

圖5 芒果蒂腐病菌對ZB5和ZB6的抑制

2.3 拮抗菌DNA提取的效果

提取結(jié)束后，取3 μL 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在全自動凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察、拍照并記錄結(jié)果，見圖7。

2.4 PCR反應(yīng)結(jié)果

PCR 反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在全自動凝膠成像分析系統(tǒng)上觀察、拍照并記錄結(jié)果見圖8。

2.5 PCR產(chǎn)物回收效果

1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照見圖9。

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生細(xì)菌分離獲得數(shù)量的多少與消毒劑及其作用時(shí)間有密切關(guān)系。消毒劑殺菌能力越強(qiáng)，作用時(shí)間越長，表面消毒就越徹底。同時(shí)，植物體內(nèi)淺表層的部分內(nèi)生細(xì)菌也被殺死，獲得的內(nèi)生細(xì)菌較少［7］。為了盡量排除竹柏表面細(xì)菌的干擾，表面消毒劑采用不同的時(shí)間處理，故從竹柏內(nèi)只分離到6株內(nèi)生細(xì)菌，數(shù)量較少。

圖6 ZB1、2和6對西瓜枯萎病菌的抑制

分離內(nèi)生菌是確定內(nèi)生菌數(shù)量的關(guān)鍵步驟，但即使使用不同種類的培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物組織也不能確保將植物組織中所有內(nèi)生菌全部分離出來，有些內(nèi)生菌不能在人工培養(yǎng)基上生長，有些內(nèi)生菌生長緩慢被生長相對較快的菌株所覆蓋。試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基為常見的培養(yǎng)基，很有可能某些稀有菌株無法生長，使得分離的內(nèi)生菌不夠全面。本試驗(yàn)獲得內(nèi)生菌比較少，一方面與植物本身有關(guān)，另一方面植物內(nèi)生菌分離因取樣、培養(yǎng)基選擇不同，其數(shù)量也會存在較大差異。試驗(yàn)分離時(shí)做了空白對照，并無菌長出，并且在前人的基礎(chǔ)上縮短了消毒時(shí)間，以防殺死一部分內(nèi)生菌。目前尚無統(tǒng)一的定性定量分析方法［8］。

圖7 DYSL5和LR5的DNA電泳圖

圖8 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖9 PCR產(chǎn)物回收電泳圖

4 展望

世界上大約有30 萬種植物，目前人們僅僅研究了其中的幾百種［9-14］，主要是關(guān)于防治植物病害的植物內(nèi)生菌研究報(bào)道比較多，并且這些內(nèi)生菌已在防治細(xì)菌性和真菌性病害上發(fā)揮了巨大的作用，但對極端環(huán)境中生長的植物及海洋植物的內(nèi)生菌研究很少，而這些植物的內(nèi)生菌更有可能產(chǎn)生一些特殊的有價(jià)值的生物活性物質(zhì)，隨著人們對植物內(nèi)生菌的發(fā)現(xiàn)、馴化和改造，內(nèi)生菌必將在微生物制藥、病原微生物防治、環(huán)境改造等方面產(chǎn)生巨大的作用；同時(shí)有望從中尋找到更有效的藥物用于病蟲害防治和維護(hù)人類健康［15］。

植物內(nèi)生菌作為生防資源的應(yīng)用潛力巨大，具有廣泛的研究價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景，隨著研究的深入，植物內(nèi)生菌將成為生物防治潛在的生物資源，同時(shí)在農(nóng)業(yè)發(fā)展以及環(huán)境保護(hù)方面都具有不可估量的價(jià)值。因此，對植物內(nèi)生菌的進(jìn)一步深入研究勢在必行。