miR-140-5p靶向HDAC4調控人骨肉瘤細胞MG-63增殖

孫玉秀，秦寶麗

0 引言

作為好發于青少年的常見的原發性惡性骨腫瘤，骨肉瘤常常被認為是兒童及青少年中癌癥相關性死亡的常見病因[1]。骨肉瘤為起源于間充質細胞的原發性惡性骨腫瘤，其惡性程度極高，生長非常迅速，轉移早，侵襲性強，預后常常不佳[2-3]。盡管近年來包括外科切除和化學治療在內的綜合治療取得了一定的進展，仍有30%～40%的患者存在復發及遠處轉移,而且這些病例的平均生存期不足1年[4]。因此，尋找與骨肉瘤增殖相關的分子并明確其作用機制，對臨床醫生和相關研究者來說都顯得尤為重要。

微小RNA (microRNAs，miRNAs)是近年來發現的長度約22～25 nt的內源性短鏈RNA[5]。MiRNAs通過轉錄水平或轉錄后水平調控各自的靶基因表達，從而在腫瘤中發揮了癌基因或抑癌基因的作用[6]。既往研究發現，miR-140-5p在多種腫瘤中表達增高且參與到腫瘤的增殖凋亡、侵襲轉移等生物學行為過程中[7-10]。本研究擬從細胞學水平探討miR-140-5p在骨肉瘤中的表達，并研究其對人骨肉瘤細胞MG-63增殖能力的影響，進一步明確其對人骨肉瘤細胞MG-63增殖的影響能否通過靶向抑制組蛋白脫乙酰基酶4(Histone deacetylase 4，HDAC4)基因來實現。

1 材料和方法

1.1 材料 人骨肉瘤細胞系MG-63以及人成骨細胞系hFOB1.19均購買于中國科學院上海生科院細胞資源中心；RNA提取試劑盒，Reverse Transcription 試劑盒，PCR試劑盒及LipofectamineTM3000轉染試劑盒購自Invitrogen公司；CCK8試劑盒購自sigma公司；HDAC4兔源單克隆抗體購自Abcam公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；miR-140-5p 模擬物(miR-140-5p mimics)及空白對照模擬物(Negative control mimic,NC mimic)由廣州銳博生物科技有限公司化學合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 人成骨細胞系hFOB1.19細胞培養于DMEM/F12培養液中并置于35 ℃、5%CO2孵箱中培養；人骨肉瘤細胞系MG-63細胞培養于DMEM培養液中并置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養。以上兩種培養基均添加10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)。

1.2.2 脂質體介導的細胞轉染 取對數生長期的MG-63細胞，調整細胞密度為2×105個細胞/孔并接種于6孔板中，添加完全培養基孵育24 h后，根據說明書采用LipofectamineTM3000轉染，將50 nmol/L miR-140-5p mimics和相應的NC mimic分別轉染到各自的細胞組中，轉染48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.2.3 載體構建及熒光素酶報告實驗 含有野生型及突變型miR-140-5p作用位點的HDAC4雙熒光素酶報告基因質粒(wt-HDAC4-luc及mut-HDAC4-luc)由上海吉瑪生物公司合成。將MG-63細胞接種于24孔板中，按照LipofectamineTM3000說明書轉染干預因素，同時共轉染wt-HDAC4-luc或mut-HDAC4-luc與miR-140-5p mimics或NC mimic。轉染24 h后，利用雙熒光素酶報告基因檢測法檢測，具體操作見說明書。

1.2.4 CCK8法檢測MG-63細胞增殖 取對數生長期的MG-63細胞，胰蛋白酶消化后調整細胞密度為2×103并接種于96孔板中，每孔加入DMEM培養基200 μl并置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。待細胞長至50%融合時，更換無血清培養基同步化。24 h后，加入血清，不同時間(24 h、48 h、72 h)加入10 μl CCK8液，繼續培養2 h，棄培養基，加入150 μl DMSO，室溫孵育10 min，上機測定A490 nm,以該值代表細胞活力。

1.2.5 Western blot檢測HDAC4蛋白表達 分組轉染48 h后提取各組細胞的總蛋白并分組標記，BCA法測定各組蛋白濃度。取200 μl樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜。封閉1 h后，分別加入HDAC4一抗(稀釋比例為1∶500)，同時加入GAPDH一抗(稀釋比例1∶500)作為對照，孵育過夜；第2天，采用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(稀釋比率為1∶1 000)室溫下孵育1 h。參照ECL試劑盒說明書行電化學發光檢測，采用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，并分組計算HDAC4蛋白相對表達量。

1.2.6 實時熒光定量 PCR檢測miR-140-5p及HDAC4 mRNA的表達 采用Trizol分組提取各組細胞的總RNA。取50 μg總RNA并使用Invitrogen的逆轉錄試劑盒，按試劑盒說明書合成cDNA。反應產物進行PCR擴增，PCR過程按Invitrogen的SYBR Green 實時熒光定量PCR 試劑盒說明書在熒光定量儀上進行，分別設定GAPDH及U6作為HDAC4及miR-140-5p的內參照，引物序列見表1。以 HDAC4 mRNA拷貝數與內參照GAPDH mRNA 拷貝數的比值為 HDAC4的相對表達量；miR-140-5p拷貝數與內參照U6 拷貝數的比值為 miR-140-5p的相對表達量。

表1 引物序列表

2 結果

2.1 人骨肉瘤細胞系MG-63和人成骨細胞系hFOB1.19中miR-140-5p及HDAC4的差異表達 人骨肉瘤細胞系MG-63中miR-140-5p呈低表達而HDAC4呈高表達，如圖1所示，Realtime-PCR及Western blot結果顯示，與正常成骨細胞系相比，人骨肉瘤細胞系MG-63中miR-140-5p表達明顯降低(圖1A)，HDAC4表達明顯升高(圖1B)。

圖1 人骨肉瘤細胞系MG-63和人成骨細胞系hFOB1.19中miR-140-5p及HDAC4的差異表達

2.2 上調miR-140-5p抑制HDAC4的表達 在MG-63細胞中轉染miR-140-5p mimics，并通過qRT-PCR確認轉染成功。結果如圖2A所示，相比轉染NC mimic組，轉染miR-140-5p組的MG-63細胞內的miR-140-5p表達明顯升高。我們進一步考察了上調miR-140-5p對HDAC4表達的影響，結果發現，相比于NC mimic轉染組，轉染miR-140-5p mimics也即上調miR-140-5p后，HDAC4的表達明顯降低(見圖2B、圖2C)。

圖2 上調miR-140-5p抑制HDAC4的表達

2.3 上調miR-140-5p抑制骨肉瘤細胞MG-63增殖 我們通過CCK8法考察了上調miR-140-5p對骨肉瘤細胞MG-63增殖的影響。如圖3所示，相比轉染NC mimic組，轉染miR-140-5p組的MG-63細胞的增殖能力明顯減弱，即上調miR-140-5p，可明顯抑制骨肉瘤細胞MG-63的增殖能力。

圖3 上調miR-140-5p抑制骨肉瘤細胞MG-63增殖

2.4 miR-140-5p 可與HDAC4 3′UTR靶向結合 我們首先通過tagetscan在線理論預測軟件預測發現，HDAC4基因的3′UTR與miR-140-5p存在理論上的7個堿基互補區，見圖4A。進一步的雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，野生型HDAC報告質粒(wt-HDAC4-luc)和 miR-140-5p mimics 共轉染后，MG-63細胞的熒光素酶活性比wt-HDAC4-luc 和NC mimic組共轉染組明顯降低 (P<0.05)；但將理論上的HDAC4 3′UTR與 miR-140-5p 的結合位點做了突變后(共轉染wt-HDAC4-luc與miR-140-5p mimics)，熒光素酶活性復又升高，也就是miR-140-5p能夠靶向作用于HDAC4 3′UTR，見圖2B。

2.5 HDAC4 cDNA逆轉miR-140-5p對MG-63增殖的抑制效應 我們將HDAC4 cDNA質粒(oe-HDAC4)及對應的空白載體質粒(pcDNA)與miR-140-5p mimics共轉染，并再次檢測HDAC4的表達，結果發現，相比于miR-140-5p mimics組及空白載體共轉染組(miR-140-5p mimics+pcDNA組)，miR-140-5p mimics+oe-HDAC4組的HDAC4的表達明顯升高(見圖5A、圖5B)。我們進一步檢測了這三組細胞的增殖能力變化，結果發現，相比于miR-140-5p mimics組及空白載體共轉染組(miR-140-5p mimics + pcDNA組)，miR-140-5p mimics + oe-HDAC4組細胞的增殖能力明顯得到了提升(見圖5C)。

圖4 熒光素酶報告基因實驗檢測 miR-140-5p與 HDAC4 3′UTR結合

圖5 HDAC4 cDNA逆轉miR-140-5p對MG-63增殖的抑制效應

3 討論

miRNA是一類在進化上高度保守且在真核生物廣泛表達的小分子單鏈RNA，通常miRNA不具有編碼功能。miRNA的表達具有嚴格的組織特異性及時間特異性，而miRNA的失常表達往往與疾病的發生發展密切相關。miRNA在腫瘤的發生發展過程中同樣起到了至關重要的調控者角色。一般來講，參與腫瘤進展的miRNA有兩大類，一類能夠促進腫瘤細胞的增殖、存活及侵襲轉移，另一大類則起到相反的作用[11]。研究表明，miRNA在多種腫瘤組織中都存在異常表達的現象，并在腫瘤的進程中發揮著癌基因或抑癌基因的效應[12]。

人miRNA-140-5p(序列號MIMAT0000431)，既往也稱miR-140，位于人染色體16q22.1，廣泛參與多種腫瘤的多種生物學行為。Fang等[7]發現，miR-140-5p能夠通過調控YES原癌基因1(YES proto-oncogene 1，YES1)的表達并抑制胃癌細胞的增殖及侵襲轉移。Yuan 等研究認為，miR-140-5p能夠抑制胰島素樣生長因子1受體(Insulin-like growth factor 1 receptor)的表達并抑制其介導的非小細胞肺癌增殖及侵襲轉移。Wei等[13]報道，miR-140-5p能夠通過打靶肌醇1，4，5-三磷酸激酶(Inositol 1,4,5-trisphosphate kinase 2，IP3k2)的方式，減輕化學藥物誘導的骨肉瘤細胞死亡。在本研究中，我們發現，miR-140-5p在人骨肉瘤細胞系MG-63中表達降低。通過轉染miR-140-5p mimics的方式上調miR-140-5p的表達后，骨肉瘤細胞系MG-63的增殖能力與NC mimic組相比明顯降低，表明miR-140-5p在骨肉瘤細胞的增殖過程中發揮了重要的調控作用。人組蛋白脫乙?；?(Histone deacetylase 4，HDAC4)基因位于人染色體2q37.3，其mRNA長度為8 980 bp，共含有37個外顯子，因此，HDAC4具有極為復雜的生物學功能。Zeng等[14]研究發現，HDAC4在食管癌中表達增高并與食管癌的不良預后及腫瘤進展密切相關。Wu等[15]報道，HDAC4在骨肉瘤中表達增高，上調miR-145-3p可抑制HDAC4的表達，并抑制骨肉瘤細胞增殖，促進其凋亡及自噬的發生。我們在前期研究中發現，HDAC4與骨肉瘤細胞的增殖和凋亡密切相關[16]。在本研究中我們發現，HDAC4在人骨肉瘤細胞系MG-63中表達明顯增高。在MG-63中上調miR-140-5p后，HDAC4的mRNA及蛋白表達均明顯降低，提示miR-140-5p可在轉錄水平調控HDAC4的表達。同時，我們通過targetsan在線軟件預測發現，miR-140-5p與HDAC4 3′ UTR區存在7個堿基互補區的miRNA作用元件(MicroRNA response elements，MREs)。因此，我們進一步通過熒光素酶報告基因實驗，驗證理論上的miR-140-5p與HDAC4 3′ UTR的靶向結合作用是否存在。結果證實，miR-140-5p可通過理論上的miRNA作用元件靶向結合于HDAC4 3′ UTR區，即HDAC4是miR-140-5p的靶基因之一。最后我們通過構建的反義實驗，驗證HDAC4在miR-140-5p介導的骨肉瘤細胞增殖中的作用。結果顯示，當我們將HDAC4 cDNA轉染到miR-140-5p過表達的細胞模型內后，miR-140-5p對骨肉瘤細胞MG-63的抑制作用被明顯翻轉，也就是說HDAC4是miR-140-5p介導的骨肉瘤細胞增殖的效應基因。以上研究結果提示，miR-140-5p可通過靶向結合于HDAC4 3′ UTR區，在轉錄水平抑制HDAC4的表達，從而抑制骨肉瘤細胞系MG-63的增殖。

綜上所述，miR-140-5p可通過靶向結合于HDAC4的3′ UTR區，并干擾HDAC4的表達，從而抑制骨肉瘤細胞的增殖。本研究結果提示，miR-140-5p/HDAC4軸在骨肉瘤細胞增殖的過程中發揮了重要的調控作用，miR-140-5p/HDAC4軸有望成為分子治療骨肉瘤的靶基因。