柑橘大實蠅滯育型與非滯育型蛹的代謝譜比較

王佳，王攀，樊歡，劉映紅

（西南大學(xué)植物保護學(xué)院，重慶 400716）

0 引言

【研究意義】柑橘大實蠅（Bactrocera minax）是一種重要的柑橘害蟲，近年來對柑橘產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失[1-3]。該蟲為一化性害蟲，越冬蛹歷期可長達6個月，其間發(fā)生專性滯育。滯育在協(xié)調(diào)昆蟲與環(huán)境之間的關(guān)系中具有十分重要的作用，探討柑橘大實蠅滯育過程中體內(nèi)物質(zhì)代謝的變化，不僅有利于了解其生長發(fā)育的內(nèi)在規(guī)律，也有助于揭示柑橘大實蠅發(fā)生滯育并適應(yīng)惡劣環(huán)境的分子機制。【前人研究進展】一化性昆蟲的專性滯育固定發(fā)生在特定的蟲態(tài)下，不需要接受任何外界因子的誘導(dǎo)[4]。柑橘大實蠅在蛹期出現(xiàn)專性滯育，但滯育起始和終止的確切時間長期以來都不明確，而新陳代謝受到強烈抑制是滯育的典型特征，因此可以將呼吸速率作為判斷滯育進程的指標[5-6]。前期通過對柑橘大實蠅整個蛹期進行呼吸速率的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在化蛹一個月以后進入深度滯育狀態(tài)，大約持續(xù)兩個月后滯育解除并恢復(fù)發(fā)育[7]。滯育是一個復(fù)雜的生理過程，而各種高通量、大規(guī)模的組學(xué)檢測分析技術(shù)為全面、深入地發(fā)掘滯育機理提供了便利，并且得到廣泛應(yīng)用[7-13]。核磁共振技術(shù)（nuclear magnetic resonance，NMR）是代謝組學(xué)研究的主要方法之一，可全面檢測生物體內(nèi)各種代謝路徑的底物和產(chǎn)物小分子代謝物水平在某種刺激或狀態(tài)下所產(chǎn)生的整體變化（量變以及質(zhì)變），來探索生命體的生物過程[14-15]。近年來，代謝組檢測在昆蟲研究領(lǐng)域中逐漸得到應(yīng)用，包括昆蟲滯育的相關(guān)研究[7,9-10,13]。目前，已有研究利用表達譜和代謝譜技術(shù)對柑橘大實蠅不同發(fā)育階段的蛹進行比較分析，發(fā)掘出在蛹滯育期與滯育前、后有顯著變化的基因和代謝物，它們可能參與到滯育的起始或結(jié)束過程中[7-8]。在此基礎(chǔ)上，進一步將滯育蛹與非滯育蛹進行組學(xué)比較分析，能夠驗證并最終明確與滯育相關(guān)的代謝物、基因和蛋白質(zhì)等。鑒于柑橘大實蠅發(fā)生專性滯育的習(xí)性，無法通過改變環(huán)境來獲取非滯育蛹，但可通過在化蛹初期注射20-羥基蛻皮酮（20E）來解除滯育[16-17]。此外，已有的柑橘大實蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)能夠為后期深入研究滯育相關(guān)生理途徑的作用機理提供基礎(chǔ)[8,18]。【本研究切入點】通過在柑橘大實蠅化蛹初期注射20E和溶劑，分別獲取非滯育型蛹（non-diapause-destined，ND）與對照滯育型蛹（diapause-destined，D），再利用NMR檢測技術(shù)對兩者的代謝組進行組內(nèi)和組間的對比分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過代謝組分析明確D型與ND型蛹各自在不同時間點之間的代謝物水平變化情況，以及相同時間點上D型與ND型蛹之間的代謝物濃度變化情況。發(fā)掘出與滯育相關(guān)的代謝物，為后續(xù)深入研究其在滯育中的作用機理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于 2017—2018年在西南大學(xué)和武漢安隆科訊技術(shù)有限公司完成。

1.1 供試昆蟲

于重慶市武隆縣一個橘園中（29°20′56″N，107°45′20″E）采集柑橘大實蠅受害果并帶回實驗室。將受害果逐一剖開，取出柑橘大實蠅老熟幼蟲，放置于沙土上使其自然入土化蛹。試驗中所使用的蛹全都埋于沙土中，并放置于室外自然環(huán)境溫度下。定期向土壤中噴水，使土壤濕度保持在適宜蛹存活的40%—70%。

1.2 非滯育型蛹與滯育型蛹的獲取

柑橘大實蠅蛹滯育類型為專性滯育，自然狀態(tài)下，所有蟲體在化蛹約1個月后都將進入深度滯育狀態(tài)。為了獲取非滯育型蛹，在化蛹后1 d內(nèi)，將20E粉末（HPLC級，Sigma公司）溶解于10%乙醇溶液中，配制終濃度為1.0 μg·μL-1的20E溶液，隨后使用微注射儀（美國Drummond公司）在蛹的尾部背面注射1.0 μL的 20E溶液以解除滯育[16]；同時，向其余部分蛹體內(nèi)注射10%乙醇溶劑以獲取對照滯育型蛹。最后將所有注射后的蛹埋入沙土中備用。

1.3 代謝物提取

在注射后的1、15和30 d，分別收集滯育型蛹（D1、D15和D30）與非滯育型蛹（ND1、ND15和ND30），將蛹置于研缽中，加入液氮充分研磨至粉末。每個時間點上的處理均設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)取1頭蛹。在每個重復(fù)中取15 mg研磨后的樣品粉末，加入500 μL純水，渦旋振蕩1 min；在冰浴中超聲波破碎4 s，間隔3 s，循環(huán)8次；13 000 r/min、4℃離心5 min后，將上清液于預(yù)洗的超濾膜（美國Millipore公司）中以13 000 r/min、4℃離心45 min過濾；取300 μL濾液與-80℃中預(yù)冷凍，然后再移至凍干機（美國LABCONCO公司）中冷凍干燥；加入135 μL重水復(fù)溶樣本，再加入 15 μL ACDSS（Anachro Certified DSS Standard Solution）標準溶液，充分混勻；13 000 r/min、4℃離心2 min后，將上清液轉(zhuǎn)移至微量管中，加入400 μL重水，將微量管裝入核磁管中，封口備用。

1.4 樣品的NMR檢測

采用NMR譜儀（Agilent DD2 600 MHz spectrometer equipped with a triple-resonance cryoprobe，美國Agilent公司）采集核磁共振譜圖。設(shè)置采集參數(shù)：溫度298.15 K，共振頻率599.79 MHz，采樣數(shù)據(jù)點32 768個，累加次數(shù)128，譜寬7 225.434 Hz。將1H NMR自由感應(yīng)衰減（free induction decay，F(xiàn)ID）信號導(dǎo)入到Chenomx NMR suit（version 8.3，Chenomx，Edmonton，Canada）軟件中，自動進行傅立葉轉(zhuǎn)換，調(diào)整相位，校正基線。以DSS峰（0.0 ppm）作為全部譜圖化學(xué)位移的標準，并對其進行反轉(zhuǎn)卷積操作，調(diào)整譜圖峰形（CSI）。根據(jù)NMR譜圖中信號的相關(guān)信息（如化學(xué)位移、峰形、半峰寬、耦合裂分等），以 DSS的濃度和譜峰面積為標準，結(jié)合 Chenomx自帶數(shù)據(jù)庫對譜圖的信號逐一比對分析，確定代謝物種類和對應(yīng)的絕對濃度值。然后把代謝物和對應(yīng)的絕對濃度值導(dǎo)出到 EXCEL表格中，得到變量矩陣，用于后續(xù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將變量矩陣作為源數(shù)據(jù)進行質(zhì)量歸一化處理，導(dǎo)入 R平臺的 PLS工具包，用偏最小二乘判別分析法（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）進行數(shù)據(jù)分析[19]，判定D型與ND型蛹各自在不同時間點之間（D1對D15對D30；ND1對ND15對ND30），以及相同時間點上D型與ND型蛹之間的代謝譜差異（D1對 ND1；D15對 ND15；D30對 ND30），通過觀察 PLS-DA得分圖上各處理樣品點之間的分離情況，判斷代謝譜差異的顯著性。樣本組之間分離越遠，則代謝譜差異越顯著，反之則越相似。此外，在PLS-DA分析的基礎(chǔ)上計算變量投影重要性值（variable importance in projection，VIP），VIP值越大說明代謝物在區(qū)分樣品中所作貢獻越大。隨后，采用SPSS21.0軟件對兩種處理組內(nèi)不同時間點的代謝物濃度進行單因素方差分析；對兩種處理組間相同時間點上的代謝物濃度進行t檢驗。同時滿足VIP＞1，且P＜0.05的代謝物被認定為在比較中具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 柑橘大實蠅蛹的NMR圖譜分析

根據(jù)柑橘大實蠅蛹的代謝物NMR歸屬圖譜，參照Chenomx自帶數(shù)據(jù)庫對30張樣本譜圖的信號進行逐一比對分析，共獲得50種代謝物及其濃度。其中，氨基酸及其衍生物20種、有機酸11種、糖類4種、核酸組分5種，其他代謝物10種（圖1）。將代謝物的濃度進行質(zhì)量歸一化處理后，得到了每種代謝物在6個不同處理間的濃度比例（圖2）。

圖1 柑橘大實蠅蛹代謝物的NMR圖譜Fig. 1 NMR spectra of metabolites in B. minax pupae

圖2 柑橘大實蠅蛹代謝物在不同處理中的濃度百分比Fig. 2 Percentage of metabolite concentrations in different treatments of B. minax pupae

2.2 代謝譜差異的PLS-DA分析

利用PLS-DA分析D型與ND型蛹在組內(nèi)不同時間點，以及組間相同時間點的代謝譜差異。共5種對比組合，分別繪制得分圖。D型蛹的3個時間點樣品在得分圖中分離較好，且每個時間點5個樣品相對聚攏，表示不同時間點樣品代謝譜差異顯著，且各處理重復(fù)性較好（圖3-A）；ND型蛹在注射20E后15 d和30 d樣品之間的分離性較差，無顯著差異，但兩者均與注射后1 d樣品之間的分離性較好，差異顯著（圖3-B）。在3個不同時間點上，D型與ND型蛹樣品在得分圖中均明顯分離，呈現(xiàn)顯著差異（圖3-C、3-D、3-E）。進一步對5種對比組合的載荷圖進行分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)代謝物集中在原點附近，表示對差異貢獻不大；少數(shù)代謝物在載荷1和載荷2方向上都遠離原點，表示對差異貢獻較大，且距離越遠，對差異貢獻越大（圖4）。

圖3 不同對比組合間的PLS-DA得分圖Fig. 3 PLS-DA scores plot for different types of comparisons

2.3 代謝譜差異的VIP分析

在PLS-DA分析的基礎(chǔ)上，計算每個代謝物的VIP值，對VIP＞1的代謝物進行方差分析或t檢驗。在5個對比組合中，共發(fā)現(xiàn)21種具有顯著差異的代謝物（VIP＞1且P＜0.05），其中，D1對D15對D30組合中有10種（圖5-A）；ND1對ND15對ND30組合中有12種（圖5-B）；D1對ND1組合中有6種（圖5-C）；D15對ND15組合中有12種（圖5-D）；D30對ND30組合中有8種（圖5-E）。在這21種代謝物中，檸檬酸、葡萄糖在5個對比組合中都差異顯著；麥芽糖和脯氨酸在 4個對比組合中差異顯著（麥芽糖：D1對D15對D30、D1對ND1、D15對ND15、D30對ND30；脯氨酸：D1對D15對D30、ND1對 ND15對ND30、D15對ND15、D30對 ND30）；海藻糖、谷氨酸、天冬酰胺和N-乙酰谷氨酸在3個對比組合中差異顯著（海藻糖、谷氨酸：D1對D15對D30、D15對 ND15、D30對 ND30；天冬酰胺：D1對D15對D30、ND1對ND15對ND30、D1對ND1；N-乙酰谷氨酸：ND1對ND15對ND30、D15對ND15、D30對ND30）。

3 討論

柑橘大實蠅D型蛹在3個時間上的代謝譜呈現(xiàn)顯著差異，這與滯育深度逐漸加強，代謝水平逐漸受到抑制有關(guān)。ND15與ND30的代謝譜差異不顯著，這可能是由于 ND型蛹在這兩個時間點上均處于解除滯育后的發(fā)育狀態(tài)，物質(zhì)代謝相對保持穩(wěn)定。D型與 ND型蛹在不同時間點上的代謝譜均具有顯著差異，但在D1對ND1組合中，差異顯著的代謝物數(shù)量較少，且大多數(shù)代謝物在PLS-DA載荷圖中分布更集中，距離原點更近，說明此時代謝譜差異小于其他兩個時間點。

圖4 不同對比組合間的PLS-DA載荷圖Fig. 4 PLS-DA loading plot for different types of comparisons

在本研究5個組合中，共有21種代謝物呈現(xiàn)出顯著差異，其中檸檬酸、葡萄糖、麥芽糖、脯氨酸、海藻糖、谷氨酸、天冬酰胺和N-乙酰谷氨酸出現(xiàn)顯著差異的次數(shù)最多，且在相應(yīng)組合中的VIP值排名靠前。這與麻蠅（Sarcophaga crassipalpis）[9]和棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）[10]中的相關(guān)研究結(jié)果相似，表明這些物質(zhì)與昆蟲滯育存在普遍聯(lián)系。在這些物質(zhì)中，檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物；葡萄糖經(jīng)糖酵解后生成丙酮酸，可作為三羧酸循環(huán)的起始物質(zhì)；麥芽糖和海藻糖可分解成葡萄糖，隨后進入糖酵解和三羧酸循環(huán)；谷氨酸和天冬酰胺經(jīng)過轉(zhuǎn)化后可分別生成三羧酸循環(huán)中間物質(zhì) 2-氧戊二酸和草酰乙酸[20]。此外，三羧酸循環(huán)中的2-氧戊二酸、丙酮酸和琥珀酸也在特定組合中呈現(xiàn)顯著差異。這些結(jié)果表明，柑橘大實蠅滯育對三羧酸循環(huán)產(chǎn)生了顯著影響。在生命體中，三羧酸循環(huán)不僅為生命體提供能量，同時也是糖類、脂類和氨基酸三者之間相互轉(zhuǎn)化的樞紐[20]。已有研究表明，三羧酸循環(huán)在昆蟲滯育期間受到抑制[9,21-23]，這與滯育期間代謝減弱相符合。另外，三羧酸循環(huán)的中間物質(zhì)還能夠刺激蛻皮激素分泌，從而調(diào)控昆蟲的滯育進程[22]。在本研究中，三羧酸循環(huán)中的檸檬酸、丙酮酸和2-氧戊二酸在解除滯育15 d和30 d后，含量顯著下降。一方面可能是因為蛹恢復(fù)發(fā)育后需要大量能量，從而增加了其消耗；另一方面可能是其轉(zhuǎn)化為了其他物質(zhì)，以保證正常發(fā)育下的物質(zhì)平衡。然而，該循環(huán)在柑橘大實蠅滯育過程中的作用仍有待進一步研究。

圖5 不同對比組合間的VIP得分圖Fig. 5 VIP scores plot for different types of comparisons

本研究發(fā)掘的一些差異顯著的代謝物還與抗逆性有關(guān)。海藻糖在昆蟲體內(nèi)發(fā)揮至關(guān)重要的作用，既能作為能量來源物質(zhì)，也能協(xié)助細胞抵御干燥、脫水、低溫及氧化等多種環(huán)境脅迫[24-26]。研究表明，許多昆蟲在越冬滯育期間通過積累海藻糖來抵御低溫[27-29]。脯氨酸也能作為昆蟲防凍劑，在低溫下避免體液結(jié)冰對細胞造成傷害[30-31]。前期研究結(jié)果表明，柑橘大實蠅 D型蛹體內(nèi)海藻糖和脯氨酸含量在深度滯育期間顯著高于滯育前和滯育后，總體含量呈倒“U”字型變化[7]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，D型蛹體內(nèi)海藻糖和脯氨酸含量在化蛹后30 d內(nèi)呈下降趨勢，而在ND型蛹體內(nèi)呈穩(wěn)定或上升趨勢。結(jié)合前后研究結(jié)果推斷，D型蛹在進入深度滯育前，由于代謝水平逐漸降低，海藻糖和脯氨酸的含量也隨之降低；進入深度滯育后，隨著氣溫的降低，海藻糖和脯氨酸的含量也隨之上升，以協(xié)助細胞抵御低溫。而ND型蛹在徹底解除滯育后，海藻糖和脯氨酸的含量與代謝水平一樣保持相對穩(wěn)定。此外，肌醇也能夠在低溫環(huán)境下為多種昆蟲提供抗凍保護，尤其是提高一些滯育越冬昆蟲的耐寒性[21,32-33]。在本研究中，隨著時間推移，D型蛹體內(nèi)的肌醇含量始終較低，而ND型蛹體內(nèi)的肌醇含量逐漸上升，這可能有助于提高耐寒性，從而應(yīng)對冬季低溫。

此外，還有一些差異顯著的代謝物具有其他重要的功能。3-羥基犬尿氨酸是色氨酸的代謝產(chǎn)物，與眼色素的形成有密切關(guān)系[34-35]，因此，ND型蛹體內(nèi)高濃度的 3-羥基犬尿氨酸可能與復(fù)眼發(fā)育需要大量眼色素有關(guān)。N-乙酰谷氨酸是尿素循環(huán)的強制激活劑，促進新陳代謝中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)氨進入尿素循環(huán)，最終轉(zhuǎn)化為無毒的尿素[36]。在注射后15 d和30 d，N-乙酰谷氨酸在 D型蛹中濃度高于非滯育型蛹，表明 D型蛹體內(nèi)將有更多的氨進入尿素循環(huán)。這可能是由于D型蛹較弱的新陳代謝抑制了氨基酸的合成，導(dǎo)致氨過剩的結(jié)果。此外，有研究報道，滯育型棉鈴蟲幼蟲可能通過在體內(nèi)積累大量尿素達到抵御低溫的作用[10]。柑橘大實蠅 D型蛹也同樣可能利用尿素來提高其耐寒性。

4 結(jié)論

在柑橘大實蠅非滯育型蛹（ND）與對照滯育型蛹（D）的5個組合（D1對D15對D30；ND1對ND15對ND30；D1對ND1；D15對ND15；D30對ND30）中，共有21種代謝物濃度至少出現(xiàn)一次顯著差異，其中檸檬酸、葡萄糖、麥芽糖、脯氨酸、海藻糖、谷氨酸、天冬酰胺和N-乙酰谷氨酸出現(xiàn)顯著差異的次數(shù)最多。這些物質(zhì)能直接或間接進入三羧酸循環(huán)，說明柑橘大實蠅滯育期間能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了顯著變化。此外，海藻糖、脯氨酸、N-乙酰谷氨酸和肌醇的顯著差異有助于調(diào)控柑橘大實蠅滯育期間的耐寒性。研究結(jié)果可為后續(xù)解析重要代謝物及相關(guān)生理途徑在柑橘大實蠅滯育中的作用機理提供依據(jù)。

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