硫對酵母生物富鉻過程中鉻脅迫的緩解作用

李函彤，甲承立，張書文，蘆晶，逄曉陽，劉鷺，呂加平

（1中國農業科學院農產品加工研究所/農業部農產品加工與質量控制重點開放實驗室，北京 100093；2北京市營養源研究所/系統營養工程技術研究中心，北京 100069）

0 引言

【研究意義】作為人體必需的微量元素，Cr（Ⅲ）可以促進機體葡萄糖代謝，降低甘油三酯和游離脂肪酸含量，維持體內糖脂代謝平衡[1]。酵母可以通過生物吸附和轉化作用將環境中的無機鉻轉化為有機鉻。這種來源于酵母的有機鉻也被稱為葡萄糖耐量因子（glucose tolerance factor，GTF）[2-4]，它具有吸收率高、安全性高的特點，被認為是最安全的鉻補充劑[5]。但作為重金屬，Cr（Ⅲ）對酵母的生長有兩面性。一方面，低濃度的鉻可促進酵母的生長；另一方面，高濃度的鉻可對酵母生長造成一定的氧化脅迫作用，抑制酵母的正常生命活動、生長和GTF的生成。因此，研究釀酒酵母在富集 Cr（Ⅲ）形成葡萄糖耐量因子（GTF）過程中自身抗氧化機制以及硫在該過程中發揮的作用，對揭示硫降低鉻脅迫，進而提高生物富鉻的作用機理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】環境中的氧化還原劑或重金屬等能刺激細胞產生超氧負離子、羥基和過氧化氫等內源性活性氧族物質（reactive oxygen species，ROS）等代謝產物。這些代謝產物在細胞中累積到一定程度，可對DNA、脂質和蛋白質等細胞組分造成一定的損害，進而影響細胞的功能甚至造成細胞死亡[6]。研究發現，高濃度 Cu2+會對酵母造成脅迫作用[7-8]，銅是氧化還原反應的活潑因子，參與Fenton反應[9]，產生有害的氫氧根離子[10]，氫氧根離子可引起細胞膜脂質、蛋白質的氧化以及 DNA和RNA分子的解鏈，導致細胞的死亡[11]。重金屬會對生物造成氧化應激，破壞 DNA結構，抑制酶的功能，破壞蛋白質在細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡和變異過程中的作用[12-13]。據報道，Cd（Ⅱ）、As（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）可以在酵母中產生ROS，誘導酵母體內氧化應激和脂質過氧化反應從而造成酵母細胞損傷[14-16]。有研究表明，Cr（Ⅲ）容易與酵母中 DNA和其他生物組分形成穩定的胞內配體，特別是與抗壞血酸鹽、組氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等[17]。劉鷺等[18]研究發現，培養液中高濃度Cr（Ⅲ）（800 μg·mL-1）嚴重抑制菌體生長；而低濃度的 Cr（Ⅲ）（200—400 μg·mL-1）對菌體的生長具有輕微刺激作用，但有機鉻富集率較低。高氧化價態的金屬在硫的作用下可以轉變為低價態[19]，硫的補充可以降低Cr（Ⅵ）對于酵母細胞的毒性，促進酵母對廢水液中Cr（Ⅵ）的吸收[20]。【本研究切入點】關于 Cr（Ⅲ）對酵母在生成 GTF過程中產生的氧化脅迫作用鮮有報道，而針對緩解鉻的氧化脅迫作用、提高酵母富鉻含量的研究更少。本研究利用前期轉錄組學結果對比分析了富鉻酵母和對照酵母的差異基因及其代謝通路，發現酵母富鉻過程與硫代謝和GSH代謝通路有密切的關系?；谝酝墨I報道硫吸收和 GSH生物合成相互聯系，并在緩解重金屬Cr（Ⅵ）對微生物的脅迫時發揮了重要的作用[21]，本研究擬在富鉻酵母發酵過程中添加不同種類的硫化合物，對比觀察富鉻酵母的生長，包括富集有機鉻、總鉻以及體內氧化應激的變化?！緮M解決的關鍵問題】基于轉錄組學對酵母富鉻代謝通路的分析結果，研究不同種類的硫對酵母富鉻以及體內氧化應激的影響，揭示硫對Cr（Ⅲ）脅迫下酵母生物富鉻調節機制，為酵母生物富集鉻生成 GTF的發酵條件優化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株和對照菌株均為釀酒酵母YSI-3.7，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC No.2687）。YPD培養基（大豆蛋白胨 20 g，葡萄糖20 g，酵母浸粉10 g，蒸餾水1 L，pH 5.8，121℃，滅菌 15 min）的大豆蛋白胨和酵母浸粉，北京奧博星生物技術公司；葡萄糖、無水亞硫酸鈉、硫化鈉，國藥集團；硝酸、氨水和高氯酸，上海晶純科技公司；三氯化鉻（Ⅲ）六水化合物，上海阿拉丁公司。

1.2 試驗設計

以高產GTF的YSI-3.7為出發菌株，研究和分析不同濃度（0、200、500 和 800 μg·mL-1）Cr（Ⅲ）對酵母富集Cr（Ⅲ）情況及氧化應激的影響，尋找酵母培養最適Cr（Ⅲ）濃度；在最適Cr（Ⅲ）濃度條件下（500 μg·mL-1），對比研究不同種類硫化合物（Na2SO3、Na2S、（NH4）2SO3）對緩解 Cr（Ⅲ）脅迫的氧化應激的影響；在最適硫化合物及濃度下（1 mmol·L-1Na2SO3），測定酵母菌體生物量、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（CAT）、還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、谷胱甘肽氧化酶（GSH-PX）、總巰基、總抗氧化能力（T-AOC）等參數，探討硫對Cr（Ⅲ）脅迫下酵母生物富鉻調節機制。

1.3 方法

1.3.1 富鉻酵母 YSI-3.7培養 將通過梯度鉻平板（200、500、800 和 1 000 μg·mL-1Cr（Ⅲ）篩選出的富鉻能力最強、生物量最大的釀酒酵母 YSI-3.7單菌落（有機鉻含量 1 033.91 μg·g-1DCW，總鉻含量 1 603.87 μg·g-1DCW，生物量 1.041 g/100 mL YPD）接種于YPD培養基中培養至第3代，然后以10%（v/v）接種量分別接種于含有一定鉻濃度的YPD培養基中，于恒溫培養振蕩器中28℃、200 r/min搖瓶培養44 h。于4℃、6 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌3次，稱其濕重；-60℃冷凍干燥48 h得到凍干菌粉。

1.3.2 有機鉻、總鉻含量的測定 參考火焰原子吸收法[22]。

1.3.2.1 富鉻酵母菌體中有機鉻測定 富鉻酵母中有機鉻可溶于氨水，稱取0.1 g凍干酵母菌粉溶于10 mL 0.1 mol·L-1氨水溶液中，于37℃、200 r/min提取3 h。于4℃、5 000 r/min離心10 min，收集上清液于溶樣杯中，加入6 mL濃硝酸。將其置于加熱板于160℃預加熱30 min，再加入0.5 mL高氯酸和5 mL 5%（m/v）的過硫酸銨，進行微波消解，參數如表 1所示。消解完全后用10% NH4Cl溶液定容至25 mL，參照GB/T15555.6—1995火焰原子吸收光譜法測定消化液中鉻含量，即為富鉻酵母菌體中有機鉻的含量。

1.3.2.2 富鉻酵母菌體總鉻測定 直接稱取0.1 g凍干菌粉于溶樣杯中，加入6 mL濃硝酸。將其置于加熱板于160℃預加熱30 min，再加入0.5 mL高氯酸和5 mL 5%（m/v）的過硫酸銨，進行微波消解，微波消解參數設置如表1所示。消解完全后用10% NH4Cl溶液定容至25 mL，參照GB/T15555.6—1995火焰原子吸收光譜法測定消化液中鉻含量，即為富鉻酵母菌體的總鉻含量。

1.3.3 相關生理指標的測定

1.3.3.1 丙二醛（MDA）含量 取菌體破壁、離心后的上清液，按照丙二醛（MDA）測試盒說明書步驟進行。

1.3.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活力 取菌體破壁、離心后的上清液，按照超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒說明書步驟進行。

1.3.3.3 過氧化氫酶（CAT） 取菌體破壁、離心后的上清液，按照過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒說明書步驟進行。

1.3.3.4 谷胱甘肽（GSH，GSSG） 取菌體破壁、離心后的上清液，按照GSH和GSSG檢測試劑盒說明書步驟進行。

1.3.3.5 總抗氧化能力（T-AOC） 取菌體破壁、離心后的上清液，按照 T-AOC檢測試劑盒說明書步驟進行。

1.3.3.6 總巰基 取菌體破壁、離心后的上清液，按照巰基檢測試劑盒說明書步驟進行。

1.3.3.7 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px） 取菌體破壁、離心后的上清液，按照谷胱甘肽檢測試劑盒說明書步驟進行。

1.4 數據分析

應用SPSS16.0對所有數據進行統計分析和繪圖。

2 結果

2.1 Cr（Ⅲ）脅迫對酵母YSI-3.7生物富鉻及氧化應激影響

2.1.1 生物量及富鉻情況 隨著培養液中 Cr（Ⅲ）濃度的升高，YSI-3.7菌體富集鉻的總量升高（包括有機鉻和總鉻），生物量下降。與對照組（Cr（Ⅲ）濃度為 0）酵母相比，200、500 和 800 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下酵母生物量分別降低 24.29%、30.71%和67.86%。在500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下，酵母中的有機鉻含量達到725.55 μg·g-1DCW，有機鉻率最高，達到57.79%；酵母于800 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下雖然吸附的總鉻高至1 812.22 μg·mL-1，但生物量降低較為嚴重，并且有機鉻率僅為29.59%（表1）。綜合考慮菌體生物量以及富集鉻的情況，Cr（Ⅲ）濃度為500 μg·mL-1為酵母發酵富鉻最佳濃度。

表1 Cr（Ⅲ）對酵母YSI-3.7生物量及生物富鉻的影響Table 1 Effect of Cr (Ⅲ) on YSI-3.7 growth and its chromium enrichment

2.1.2 Cr（Ⅲ）脅迫對酵母 YSI-3.7氧化應激影響通過研究Cr（Ⅲ）脅迫對酵母YSI-3.7各氧化應激指標的影響可知（表2），酵母細胞中丙二醛（MDA）的含量隨著培養基中 Cr（Ⅲ）濃度的增加而增加。MDA的量可以反映酵母細胞內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。200、500和 800 μg·mL-1鉻濃度下，丙二醛含量分別比對照組增加31.36%、42.94%和52.49%。

隨著Cr（Ⅲ）濃度升高，YSI-3.7中SOD活力略有下降，在 200、500 和 800 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下，分別比對照組下降3.83%、7.90%和14.63%。在對照酵母中，CAT的活力可達到 9.09 U·mg-1prot，隨著Cr（Ⅲ）濃度升高，CAT活力有所下降，在200、500和800 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下，分別比對照組下降13.86%、48.07%和59.96%。

在對照酵母中，還原型谷胱甘肽（GSH）含量隨著Cr（Ⅲ）濃度升高，呈現先增加后減少趨勢，GSH含量于 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ） 濃度下達到最高 48.52 μmol·g-1prot。在 200、500 和 800 μg·mL-1Cr（Ⅲ） 濃度下，分別比對照組增加28.01%、54.42%和39.53%。與GSH變化趨勢不同，氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量隨著Cr（Ⅲ）濃度的升高而升高，在Cr（Ⅲ）濃度為800 μg·mL-1時含量達到最高，為15.46 μmol·g-1prot，比對照組增加96.69%。在Cr（Ⅲ）濃度為200、500 μg·mL-1時，GSSG 的含量也高于對照組，分別增加21.63%和57.51%。GSH/GSSG通常用來表示生物體的抗氧化能力。GSH/GSSG的比值在對照組中為4，在Cr（Ⅲ）濃度為200、500和800 μg·mL-1時分別為4.21、3.92和2.84。

Cr（Ⅲ）添加濃度為 200 和 500 μg·mL-1時，培養基中巰基含量分別比對照組提高 38.77%和 53.34%。在800 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下，巰基含量相對于對照組酵母降低約 7.19%。酵母細胞中總抗氧化能力(T-AOC)于 0—500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）濃度下持續升高。當Cr（Ⅲ）濃度繼續升高至 800 μg·mL-1時，T-AOC比對照降低56.25%。培養基中Cr（Ⅲ）濃度從0升高到500 μg·mL-1時，酵母細胞中T-AOC持續升高，說明在此濃度范圍內，Cr（Ⅲ）脅迫使酵母細胞的抗氧化能力提高，而當Cr（Ⅲ）濃度升高至800 μg·mL-1時，酵母細胞的抗氧化能力降低，并且遠低于對照組。說明高Cr（Ⅲ）對酵母造成了很大的破壞作用，酵母自身的抗氧化能力已經不足以應對此濃度下Cr（Ⅲ）的氧化脅迫。

2.2 不同硫化合物對鉻脅迫下酵母 YSI-3.7生物量及生物富鉻的影響

由表3可以看出，培養基中添加不同硫酸鹽培養的酵母細胞生物量（干重）幾乎均隨著其濃度的增加而減少。其中有機鉻含量隨著培養基中添加Na2SO3、Na2S、（NH4）2SO3濃度的升高先增加后減少，并分別在濃度5、1和1 mmol·L-1時達到最大值。對于培養基中添加 Na2SO3和（NH4）2SO3的酵母而言，酵母中總鉻含量隨著亞硫酸鹽添加濃度的升高先增加后減少，分別在5、15 mmol·L-1時達到最大值。而對于添加Na2S的酵母，其總鉻的含量在0.5—15 mmol·L-1濃度持續增加。對于培養基中添加 Na2SO3、Na2S的酵母，其有機鉻率均先上升后下降，且均在濃度為1 mmol·L-1時達到最大值，分別為對照的85.65%和67.75%。而對于添加（NH4）2SO3后發酵的酵母，其有機鉻率隨著其濃度升高而下降。結合細胞干重、有機鉻、總鉻、有機鉻率等指標，當在培養基中添加

1 mmol·L-1Na2SO3時，對于酵母富集Cr（Ⅲ）形成有機鉻最有利。此時，酵母細胞生物量為只添加 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）的84.83%，總鉻含量提高31.03%，有機鉻率提高32.88%。綜上，選擇1 mmol·L-1Na2SO3進行后續研究。

表2 Cr（Ⅲ） 對酵母細胞氧化應激的影響Table 2 Effect of Cr (Ⅲ) on YSI-3.7 oxidative stress

表3 硫化合物對釀酒酵母YSI-3.7生物量及生物富鉻的影響Table 3 Effect of various S compounds on YSI-3.7 biomass and its chromium enrichment

2.3 Na2SO3對酵母YSI-3.7富鉻及鉻脅迫下氧化應激的影響

2.3.1 對應激代謝產物的影響 氧自由基能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，形成脂質過氧化物，如丙二醛。MDA的量可以反映酵母細胞內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。如圖1-A所示，500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母體內MDA含量為16.91 nmol·mL-1，相比于空白組，提高了24.60%；1 mmol·L-1Na2SO3可有效降低因Cr（Ⅲ）引起的 MDA 含量，相比于500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理組，MDA含量降低了12.8%。

如圖1-B所示，500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母體內巰基含量為 59.05 μg·g-1prot；1 mmol·L-1Na2SO3可促進富鉻酵母體內巰基含量的增加，達到 65.51 μg·g-1prot；相比于 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理組，巰基含量提高了16.87%。

如圖1-C所示，500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母細胞內還原型谷胱甘肽（GSH）含量為 48.52 μmol·g-1prot，相比于對照酵母組增加了54.42%。1 mmol·L-1Na2SO3可促進富鉻酵母體內GSH 增加至62.51 μmol·g-1prot。相比于空白組和500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理組分別提高98.95%和28.83%。

如圖 1-D 所示，500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母體內氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量為 12.38 μmol·g-1prot，相比于空白酵母組增加 57.71%。1 mmol·L-1Na2SO3可促進富鉻酵母體內 GSSG 降低至7.85 μmol·g-1prot。相較于 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理組，GSSG降低了57.71%，與空白組酵母體內GSSG含量近似。

圖1 Na2SO3對鉻脅迫下酵母氧化應激代謝產物的影響Fig. 1 Effects of Na2SO3 on reactive oxygen species related intermediate metabolites by YSI-3.7

2.3.2 對酵母抗氧化能力的影響 金屬離子的氧化脅迫會激活微生物機體自身抗氧化保護酶系統，消除自由基，維持體內自由基動態平衡[23]。如圖2-A 所示，500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母體內SOD含量為7.93 U·mg-1prot，相比于空白酵母組降低7.9%。1 mmol·L-1Na2SO3可促進富鉻酵母體內SOD 增加至 8.28 U·mg-1prot，比 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）單獨處理組提高4.41%。空白對照組中酵母的 CAT的活力達到 9.09 U·mg-1·prot；其他兩組處理相比，酵母細胞中 CAT活力無顯著變化（圖2-B），表明硫的添加對SOD、CAT的活力提高不明顯。

總抗氧化能力（T-AOC）是衡量機體抗氧化酶系統和非酶促系統功能狀況的綜合性指標。它的大小可代表和反映機體抗氧化酶系統和非酶系統對外來刺激的代償能力以及機體自由基代謝的狀態。由圖2-C所示，在Cr（Ⅲ）脅迫下，酵母的總抗氧化能力有所提升，酵母發揮自身調節作用以對抗外界氧化脅迫作用；500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母體內T-AOC含量為1.61 U·g-1prot，相比于空白酵母組提高 101.25%。1 mmol·L-1Na2SO3可促進富鉻酵母體內T-AOC增加至1.84 U·g-1prot，分別比空白酵母和500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理組中T-AOC含量提高130%和14.29%。表明硫的添加可以提高酵母的總抗氧化能力。

谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）可以促進過氧化氫（H2O2）與還原型谷胱甘肽反應生成 H2O和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。由圖2-D可知，500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理的酵母體內GSH-Px含量為763.94 U·mg-1prot，相比于空白酵母組降低 26.86%。1 mmol·L-1Na2SO3可使富鉻酵母體內 GSH-Px增加至907.53 U·mg-1prot，比 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）處理組提高18.80%。以上結果表明，硫的添加可以提高谷胱甘肽過氧化物酶的活力，促進氧化氫（H2O2）與還原型谷胱甘肽反應，促進過氧化氫的分解。

圖2 Na2SO3對酵母抗氧化能力的影響Fig. 2 Effect of Na2SO3 on YSI-3.7 antioxidant capacity

3 討論

動物、植物細胞在代謝過程中不斷產生自由基，這些自由基會被細胞本身具有的防御體系所清除，在正常生理條件下，二者之間始終處于動態平衡。一旦平衡被打破，機體組織內的活性氧自由基不斷聚積，使組織代謝功能出現異常并發生組織過氧化現象，從而引發一系列病理及生理變化[24]。過量的重金屬會誘導活性氧基團（ROS）的產生，如超氧離子（O2-）、羥基(-OH)、過氧化氫（H2O2）等活躍的微粒。這些微粒能與大量細胞成分反應，氧化核酸、蛋白質、糖類和脂肪等大分子，引起細胞內氧化應激反應導致細胞死亡[25]。鉻和其他金屬一樣，會顯著誘導活性氧的產生，可以直接或者間接地對生物體中核酸、葉綠體結構和細胞膜造成破壞[26]。PEREIAR等[27]在研究氧化脅迫與酵母抗逆性的關系時也發現，在高溫、饑餓、金屬離子等逆境因子存在時可誘使酵母細胞產生活性氧ROS。ROS的清除主要包括非酶促和酶促兩種機制。其中，非酶促清除機制主要依賴于抗壞血酸、谷胱甘肽、類黃酮和生物堿等還原性物質[28]；而酶促清除機制則依賴于超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶等[29]。KEUNEN 等[30]認為，鉻（Ⅵ）主要通過硫轉運體進入細胞，并且競爭性地抑制硫的攝取，導致硫饑餓，從而引起硫攝取量的減少。在這兩者競爭下，硫的補充可以解除鉻的毒性，使酵母生長狀態變好，蛋白含量增加。GSH等含半胱氨酸殘基的巰基化合物，具有抗氧化、提高機體免疫、重金屬解毒，維持生物細胞特定的氧化還原氛圍等多種生物學功能，是生物細胞內重要的活性物質。硫在蛋白質中的保存增加了GSH的合成。硫通路的激活，不僅可以控制GSH的合成，而且保存蛋白中的硫，為GSH的合成提供S原子。

3.1 Na2SO3對酵母膜脂質過氧化程度的影響

六價鉻脅迫可能會導致脂質的過氧化以及細胞膜損傷，產生氧化應激損傷[31-32]。在脅迫下，植物組織和器官膜脂質過氧化的主要產物是丙二醛，細胞膜發生過氧化后細胞內電解質大量滲透。植物體內 MDA的含量和細胞膜透性可以一定程度上反應植物受脅迫損傷的程度，也能反映細胞膜所受傷害程度的高低[33-34]。Cd2+脅迫可以使美人蕉 MDA 含量升高[35]，SHAH等[36]在Cd2+處理的兩種水稻品種中均檢測到了 MDA的積累。杜君等報道，銅脅迫可以使釀酒酵母膜脂過氧化程度加劇且細胞內丙二醛含量隨著銅處理濃度的增加而增加[37]。Al3+作用可以造成煙草細胞的膜脂過氧化[38]，對酵母的毒性很大程度上也是膜脂過氧化造成細胞膜完整性和流動性消失引起的[39]。本研究發現，酵母富鉻過程中，隨著 Cr（Ⅲ） 濃度的升高，酵母中 MDA含量上升，說明酵母細胞膜質過氧化的程度升高，細胞膜所受傷害程度不斷加深。適當濃度的 Na2SO3可以使酵母細胞中MDA含量降低，緩解細胞膜脂質過氧化的程度。有報道指出，H2S可以增強抗氧化酶活性，參與調節鹽脅迫下植物活性氧代謝，顯著降低O2-、H2O2和MDA含量，緩解鹽脅迫引起的氧化損傷[40-42]。

3.2 Na2SO3對酵母生物富鉻過程中抗氧化能力的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是細胞中最重要的清除自由基的酶之一，以為基質進行歧化反應，將毒性較強的轉化為毒性次級的H2O2和基態氧，避免毒性更大的·OH的生成。研究表明，Cd2+使美人蕉根部 SOD活性明顯增加，Cu2+對其活性無明顯影響[35]。釀酒酵母細胞內超氧化物歧化酶活性在不同濃度銅脅迫下有不同程度的升高[37]。本研究中添加 Na2SO3后酵母中 SOD活力比只添加 500 μg·mL-1Cr（Ⅲ）略有上升，說明Na2SO3可以通過提高酵母 SOD活力抵抗鉻脅迫。本研究還發現，Cr（Ⅲ）可降低酵母體內 CAT含量，使酵母體內過氧化氫分解能力減弱，外源添加 Na2SO3對 CAT酶系沒有影響。杜君等[37]發現，釀酒酵母細胞內氧化氫酶的活性在不同濃度銅脅迫下有不同程度的升高。三價鉻和銅對酵母過氧化氫酶影響不同，可能與酵母對不同種的金屬的抗氧化能力和途徑有所不同有關。

GSH是含半胱氨酸殘基的巰基化合物，具有抗氧化、提高機體免疫、重金屬解毒，維持生物細胞特定的氧化還原氛圍等多種生物學功能，是生物細胞內重要的活性物質[31]。生物體對重金屬的抗逆性、解毒及積累作用與生物細胞內含有豐富的GSH和金屬硫蛋白等疏基化合物有關[42-45]。Fe3+、Cu2+、Cr（Ⅲ）這些變價離子在脅迫細胞時，與酵母細胞中的巰基化合物中巰基發生直接的配位作用[46]。有研究表明，鎘處理誘導了水稻根系產生大量的包括還原型谷胱甘肽在內的含巰基物質。谷胱甘肽幾乎是所有活細胞中抗氧化劑中最豐富的物質。鉻對酵母細胞既然存在氧化脅迫，那么，酵母細胞內必然也存在相應的反應機制來對抗或消除氧化毒性。研究結果說明低濃度的Cr（Ⅲ）可以刺激酵母產生GSH，抵抗氧化毒性。GSH被稱為生物體中抵抗重金屬壓力的緩解劑[47]。GSH在緩解氧化毒性中具有多種功能，如：動物呼吸作用產生的 H2O2由線粒體中的谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）消除，而 GSH就是該酶的電子供體；在植物中，GSH也是活性氧自由基防御反應中的關鍵因子，并作為一種植物螯合肽底物，可以幫助植物應對金屬毒性[48-50]，如抵抗氧化劑對巰基（-SH）的破壞，與α-生育酚協調清除細胞中積累的氧自由基。GSH還被發現在釀酒酵母的熱激、H2O2、Hg、Cu等引起的氧化脅迫中起到關鍵作用[51-54]。谷胱甘肽在體內以還原型(GSH)和氧化型(GSSG)兩種形式存在，正常時主要以還原型為主，具有清除自由基的能力，可在谷胱甘肽過氧化酶(GPx)的催化下與過氧化物、自由基等反應，形成氧化態的 GSSG，GSSG又可在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)和 GSH 還原酶(GSR)的作用下還原成GSH，形成一個循環，這個過程被認為是谷胱甘肽最重要的抗氧化機制。此外，一些報道發現，GSH還具有其他抗性功能。有報道認為，GSH可以保護一些同樣含巰基的蛋白質及酶免受氧化，也可以作為一些酶的輔助因子或者具有調節相關氨基酸的運輸等功能[55]。還有人發現，GSH可以直接與 Cd等金屬螯合形成復合物儲存到液泡中[13]，在植物中，GSH還是植物螯合肽的合成底物[7]。GSH/GSSG是氧化壓力的生物標志[56]。隨著Cr（Ⅲ）濃度不斷升高（0—800 μg·mL-1），GSH/GSSG 分別為 4、4.2、3.9和 2.8，呈先升高后下降的趨勢，說明酵母對低濃度的Cr（Ⅲ）自身抗氧化能力較強，對高濃度的鉻抵抗力變弱。

總抗氧化能力（T-AOC）是衡量機體抗氧化酶系統和非酶促系統功能狀況的綜合性指標。它的大小可代表和反映機體抗氧化酶系統和非酶系統對外來刺激的代償能力以及機體自由基代謝的狀態[57]。在低 Cr（Ⅲ）濃度下（≤500 μg·mL-1），機體自身氧化應激調整，酵母細胞中總抗氧化能力升高；而高濃度Cr（Ⅲ）脅迫下，總抗氧化能力遠低于對照組，酵母細胞的抗氧化能力降低，說明高Cr（Ⅲ）對酵母造成了很大的破壞作用，酵母自身氧化應激的調整無法應對此濃度下Cr（Ⅲ）的氧化脅迫。適當濃度的 Na2SO3使酵母細胞 T-AOC進一步升高，表明Na2SO3可以通過提高酵母總抗氧化能力防御Cr（Ⅲ）帶來的氧化作用。

4 結論

酵母在富集Cr（Ⅲ）形成GTF過程中，會受到Cr（Ⅲ）的氧化脅迫作用。較低濃度 Cr（Ⅲ）會刺激酵母細胞生長，而較高濃度的 Cr（Ⅲ）則會抑制其生長。酵母細胞的膜脂過氧化程度隨 Cr（Ⅲ）濃度的升高而加重。在較低濃度 Cr（Ⅲ）作用下，酵母自身可通過增加 T-AOC、GSH、巰基含量以及GSH-Px活力以防御 Cr（Ⅲ）的氧化脅迫。但在高Cr（Ⅲ）濃度下，有些未得到及時清除的自由基對細胞產生不可逆的傷害，使細胞膜脂過氧化程度大大加重，酵母自身無法抵抗其氧化脅迫作用。適當濃度Na2SO3可以通過增加酵母中-SH、GSH、T-AOC含量，提高GSH-Px酶活力，降低膜脂過氧化程度，從而幫助酵母細胞抵御一定濃度的 Cr（Ⅲ）氧化脅迫作用，進而提高有機鉻生成率。

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