代謝組學解析遮陰對茶葉主要品質成分的影響

陳勤操，戴偉東，藺志遠，解東超，呂美玲，林智

（1中國農業科學院茶葉研究所/農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，杭州 310008；2中國農業科學院研究生院，北京 100081；3安捷倫科技（中國）有限公司，北京 100102）

0 引言

【研究意義】茶因其迷人的風味及出色的保健功效而日益受到人們喜愛。滋味作為影響茶葉感官品質的一個重要因素，很大程度上決定了消費者對茶葉的選擇。茶葉的滋味主要由茶多酚、咖啡堿、氨基酸、黃酮（醇）及其糖苷、可溶性糖等呈味成分決定[1]，而這些呈味成分的合成與積累又顯著受茶園環境條件和管理措施的影響。高溫和強光照被認為是造成茶葉苦澀味較重的重要因子[2-3]，因此，生產上常利用遮陰處理來改善茶園環境，提高茶葉品質。詳細研究遮陰與茶葉代謝和品質成分的關系，可以更好地在生產實踐中利用遮陰來改善茶葉品質。【前人研究進展】目前已有諸多遮陰改變茶園環境、茶葉代謝與品質成分的報道。研究表明，遮陰可以降低樹冠面溫度、光強，提高空氣相對濕度[4]；降低地面和土壤溫度，提高土壤水分含量[5]；顯著降低樹冠層的日極端最高溫度、溫度日較差和相對濕度日較差[3]。遮陰后的茶葉，普遍出現總多酚含量降低，氨基酸含量升高，酚氨比下降[2-3,6]；兒茶素品質指數增加[2,4]；咖啡堿含量升高[7-9]；黃酮（醇）及其糖苷含量下降[10-11]；葉綠素含量增加[7,12]；粗纖維含量降低[3,13]；可溶性糖含量增加[13]；氮磷鉀等養分含量增加[4]。此外，遮陰對茶葉的香氣成分也有明顯的影響[14-16]。目前，代謝組學已廣泛應用于植物生理代謝、食品加工等領域。本課題組前期已建立了良好的茶葉代謝組學研究平臺，并已廣泛應用于茶葉滋味成分鑒定[17]、茶葉生理代謝[18]、茶葉加工[19-20]等方面的研究中。【本研究切入點】目前的研究主要聚焦在30%—95%的遮陰水平對茶葉代謝與品質成分的影響，對于黑暗遮陰對茶葉代謝與品質成分的影響則尚無詳細的研究報道。此外，受檢測技術的限制，以上研究主要集中在常規成分（如兒茶素類、咖啡因、氨基酸、沒食子酸等）上，導致許多對滋味有重要作用的化合物被遺漏，如兒茶素聚合物、核苷（酸）等[17]。代謝組學方法以生物體內代謝組為研究對象，具有高效、全面及準確的特點。【擬解決的關鍵問題】本研究對茶樹進行中度遮陰（65.0%）和黑暗遮陰（99.7%）處理，同時采用UHPLC-Q-TOF/MS對遮陰后茶葉中主要品質成分進行分析，以期更加詳細地了解遮陰與茶葉品質的關系。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

代謝組學分析：超高效液相色譜（Infinity 1290，Agilent Tech，美國）串聯四級桿飛行時間質譜（Q-TOF 6540，Agilent Tech，美國）；兒茶素、沒食子酸與咖啡堿檢測：超高效液相色譜系統（Acquity H-Class，Waters，美國）；紫外分光光度計為 UV-3600（Shimadzu，日本），光量子儀為LI-190SA（Lincoln，美國）。

LC-MS級甲醇購于美國Merck公司；福林酚購于麥克林公司；沒食子酸一水結合物購自阿拉丁公司；分析純茚三酮購于Kermel公司；AlCl3購自上海美興化工股份有限公司；蘆丁購自百靈威公司；兒茶素與咖啡堿標準品購自Sigma-Aldrich公司；甲酸（>99.0%）購于日本TIC公司；試驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 樣品處理

遮陰處理：試驗茶園（北緯 30°10′52″，東經120°5′26″），品種為‘龍井 43’，遮陰時期為 2018年5月19—28日，共10天，主要為陰雨、多云天氣。遮陰處理如圖1-A所示，采用黑色遮陽網，設遮光率為65.0%（中度遮陰組，M組）和99.7%（黑暗遮陰組，D組）兩組處理，不遮陰作為對照（CK組）。遮陰結束后，采摘一芽二葉，放入液氮中冷凍，然后-50℃凍干36 h，磨碎后放入-20℃冰箱中保存備用。

茶湯提取：考慮到主要是考察遮陰對茶葉品質成分（即茶葉中可用水沖泡出的成分為主）的影響，同時為防止多酚類物質在高溫提取過程中被大量氧化，所以茶湯制備參照YANG等[17]方法并進行稍許改動：準確稱取0.1 g茶樣放入EP管中，加入15 mL超純水，放入100℃水中浸提10 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液用于后續分析。進超高效液相色譜系統分析前，上清液用0.22 μm濾膜過濾。

1.3 檢測方法

1.3.1 茶多酚、氨基酸、總黃酮測定 總多酚含量測定參照國標《GB/T 8313—2013》進行：先將上述茶湯稀釋20倍，然后于10 mL刻度試管內加入1.0 mL稀釋后的茶湯和5.0 mL 10%的福林酚溶液，搖勻后反應5 min，然后加入4.0 mL 7.5%的NaCO3溶液，加水定容至10 mL，搖勻后放置60 min。最后用10 mm比色皿在765 nm波長下測定吸光度。

總氨基酸含量測定參照國標《GB/T 8314—2013》進行：吸取1 mL茶湯注入25 mL比色管中，加入0.5 mL pH 8.0磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 2%的茚三酮溶液，然后在沸水中加熱15 min，待冷卻到室溫后定容至25 mL，放置10 min后用5 mm比色皿于570 nm波長下檢測吸光度。

總黃酮含量測定采用三氯化鋁法：吸取1 mL茶湯注入25 mL比色管中，加入1 mL 10% AlCl3溶液，4 mL pH 5.5的乙酸鈉溶液，定容至25 mL，反應30 min，然后于415 nm波長下用10 mm比色皿測定吸光度。

1.3.2 兒茶素類、沒食子酸、咖啡堿測定 參照YANG等[17]的方法進行：色譜柱為BEH C18 column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，Manchester，UK），柱溫為35℃。流動相：A相為0.1%的甲酸溶液，B相為純甲醇。洗脫程序為：0 min，3% B相；3 min，8% B 相；7.5 min，20% B 相；11 min，20% B 相；13 min，60% B相；14.5 min，60% B相；15 min，3% B相；19 min，3% B相。流速為 0.35 mL·min-1，進樣量為 5 μL。

1.3.3 代謝組學分析 采用UHPLC-Q-TOF/MS進行測定，色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18柱（150 mm×3.0 mm，1.8 μm，安捷倫公司，美國）。主要參數如下：色譜條件流動相A相為0.1%甲酸-水，B相為甲醇；進樣量為3 μL；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為40℃；流動相線性梯度洗脫為：0 min，10% B相；4 min，15% B 相；7 min，25% B 相；9 min，32% B 相；16 min，40% B相；22 min，55% B相；28 min，95% B相；30 min，95% B相；柱后平衡時間為5 min。質譜采用電噴霧離子化（ESI）模式，掃描方式為正離子模式；毛細管電壓為 3 500 V；干燥氣溫度和流速分別為300℃和8 L/min；霧化氣壓強為35 psi；鞘氣溫度和流速分別為300℃和11 L·min-1；質譜掃描范圍，質荷比（m/z）為100—1 000。

1.4 數據處理

UHPLC-Q-TOF/MS分析獲得的原始圖譜分別采用 DA Reprocessor software（Agilent Tech.，Santa Clara，CA）和 Mass Profiler Professional 13.0軟件（Agilent Tech.，Santa Clara，美國）進行峰匹配和積分。主成分分析（PCA）使用Simca-P 11.5軟件。Tukey s-b（K）檢驗使用PASWstat software（版本18.0，美國）軟件。

2 結果

2.1 遮陰對茶葉外觀表型及含水率的影響

遮陰后（圖1-A），茶葉的外觀表型變化如圖1-B—D所示。與對照相比，黑暗遮陰處理的茶葉顏色明顯更深更綠，這是因為適當遮陰可以增加茶葉的葉綠素含量[7,12]，以讓茶葉在弱光照條件下捕獲更多的光子，增強光合作用。然而，與中度遮陰處理的茶葉顏色變深變綠不同，黑暗遮陰處理的茶葉顏色明顯變淺，這與CHEN等[21]的結果相一致。由此可知，適當遮陰可以增加茶葉葉綠素含量，但黑暗遮陰反而會導致葉綠素被分解。另外，遮陰后，茶葉的含水率出現顯著增加（表 1），這應該為遮陰后茶園的溫度降低，空氣濕度增加，茶葉嫩度增加所致。

2.2 遮陰對茶葉多酚、氨基酸、黃酮總含量的影響

圖1 茶葉遮陰處理(A)及其外觀表型變化(B—D)Fig. 1 Shading treatment (A) and appearance changes of tea leaves (B-D)

表1 遮陰對茶葉中主要生化成分及含水率的影響Table 1 The effects of shading on main biochemical compositions and moisture content of tea leaves

一般而言，遮陰后茶葉的多酚含量會降低，氨基酸含量會上升，從而促使酚氨比下降，提升茶葉的品質[2-4,9,11]。然而，本研究的結果卻不盡一樣。如表 1所示，總多酚含量在中度遮陰處理后沒有顯著變化，然而在黑暗遮陰處理后則出現顯著增加。與對照相比，總氨基酸含量在中度遮陰和高度遮陰后均顯著下降，其中黑暗遮陰處理的含量稍高于中度遮陰處理；不管是中度遮陰還是黑暗遮陰處理，總黃酮含量與對照相比均顯著下降；酚氨比作為評價茶葉品質的重要指標之一，其在黑暗遮陰處理后顯著上升，預示高度遮陰可能不利于提高茶葉的品質。

2.3 遮陰對茶葉代謝物的影響

為了更加詳細地了解遮陰對茶葉代謝與品質成分的影響，對3組處理茶葉的代謝物進行了UHPLC-QTOF/MS分析。經過峰提取和匹配后，共得到 3 236個化合物特征離子，其中2 044個在QC樣品中RSD＜30%的特征離子用于下一步分析。PCA分析顯示3組樣品之間被明顯的區分開來，表明遮陰后茶葉的代謝物發生了明顯的變化（圖2）。

結合筆者課題組前期在代謝組學分析和化合物鑒定方面的工作[17-20]，本次總鑒定出87個化合物，包括2個生物堿、18個氨基酸、12個兒茶素類物質、8個兒茶素二聚體類物質、19個黃酮（醇）糖苷、5個香氣糖苷、6個核苷（酸）、9個酚酸、8個其他化合物，其中 82個化合物在遮陰后出現顯著差異（P＜0.05）（表 2）。此外，由于 EGCG、咖啡堿在本次LC-MS分析時因含量過高而發生信號過載，以及沒食子酸在這次正離子模式下難以被檢測，本研究進一步對兒茶素類物質、咖啡堿、沒食子酸進行了絕對定量，結果如表1所示。

表2 茶葉中鑒定到的化合物及其相對含量（峰面積，counts）Table 2 Identified compounds and their relative contents in tea leaves (peak area, counts)

續表2 Continued table 2

續表2 Continued table 2

2.3.1 遮陰對氨基酸（amino acids）的影響 氨基酸被認為是茶湯鮮爽味的重要貢獻者，但有報道顯示只有茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺才呈鮮味，其他氨基酸則呈苦味或甜味[22]。如表2所示，所有鑒定到的氨基酸均表現為極顯著差異，但是變化趨勢不盡相同。其中組氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、色氨酸的含量隨遮陰出現顯著上升；賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、哌啶酸、纈氨酸、焦谷氨酸、絡氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸的含量隨遮陰出現顯著下降；茶氨酸和亮氨酸的含量在中度遮陰處理后下降，在黑暗遮陰處理后上升。

圖2 3組樣品的主成分分析得分圖（R2X=0.757, Q2=0.687）Fig. 2 PCA score plot of 3 sets of samples (R2X=0.757, Q2=0.687)

2.3.2 遮陰對兒茶素類（catechins）及兒茶素二聚體類（dimeric catechins）物質的影響 兒茶素類物質被認為是茶葉中最重要的類黃酮物質，含量上以表兒茶素為主。其在一系列酶的作用下，可以聚合生成原花青素、聚酯型兒茶素等兒茶素二聚體類物質。如表1和表2所示，與對照相比，中度遮陰處理后，非酯型兒茶素（沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素）和甲基化兒茶素（表沒食子兒茶素-3-(3-O-甲基)沒食子酸酯、表沒食子兒茶素-3- (4-O-甲基)沒食子酸酯）的含量出現顯著下降，其他兒茶素沒有出現顯著差異；黑暗遮陰處理后，大部分兒茶素類物質（表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素-3,5-二沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素-3-(3-O-甲基)沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、表阿夫兒茶精-3-沒食子酸酯）含量都出現顯著上升，沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、表阿夫兒茶精、表沒食子兒茶素-3-(4-O-甲基)沒食子酸酯的含量出現顯著降低，兒茶素和表兒茶素的含量沒有顯著變化，但相對中度遮陰處理顯著上升。對兒茶素二聚體類物質來說，中度遮陰處理后，只有原花青素 B2出現顯著降低，其他沒有顯著變化；黑暗遮陰處理后，除聚酯型兒茶素B外，所有兒茶素二聚體類物質都出現顯著上升。大部分兒茶素類物質及其二聚體含量的上升，解釋了為什么黑暗遮陰處理后茶葉多酚總量會上升。兒茶素類，尤其酯型兒茶素被認為是茶葉中最重要的苦澀味物質；此外，新近研究表明原花青素、聚酯型兒茶素類物質與白茶的苦澀味呈正相關[17]。因此，兒茶素類、原花青素類、聚酯型兒茶素類物質含量的上升可能會增強黑暗遮陰處理組茶葉的苦澀味，導致茶葉品質下降。

2.3.3 遮陰對黃酮（醇）糖苷（flavone glycosides and flavonol glycosides）的影響 如表2所示，本次研究中主要檢測到由芹菜素、槲皮素、山奈酚、楊梅酮生成的黃酮（醇）糖苷。中度遮陰處理后，大部分黃酮（醇）糖苷含量都出現了顯著下降；黑暗遮陰處理后，幾乎所有黃酮（醇）糖苷在中度遮陰處理組基礎上，其含量出現進一步降低，但槲皮素二葡萄糖苷的含量顯著上升，這與 WANG等[10]的研究結果一致。黃酮（醇）糖苷一般認為是綠茶的重要呈色物質，有研究顯示黃酮（醇）糖苷具有澀味，是紅茶、綠茶的主要澀味成分[22-23]，可以增強茶湯的苦澀口感[24]，其含量的下降或許可以在一定程度上降低茶湯的苦澀味。

2.3.4 遮陰對香氣糖苷（glycosidically bound volatiles）的影響 茶葉中揮發性成分除以游離的形式存在外，某些醇類香氣，如順-3-己烯醇、苯甲/乙醇、芳樟醇等也可以和櫻草糖、葡萄糖等結合生成香氣糖苷，作為香氣前體物質而存在于茶葉中[25]。中度遮陰處理后，5個香氣糖苷的含量都出現了顯著上升；黑暗遮陰處理后，除芳樟醇氧化物櫻草糖苷的含量顯著降低外，其他4個香氣糖苷的含量在中度遮陰處理的基礎上進一步顯著上升（表 2）。近期研究表明，香氣糖苷對紅茶、白茶的香氣形成具有重要貢獻[26-27]。因此，香氣糖苷含量的上升，可能有利于在茶葉加工過程中，水解釋放更多的香氣，改善茶葉的香氣品質。因此，遮陰處理改善茶葉的香氣品質除了增加香氣總量和豐富香氣種類外[14-16]，還可能通過提高茶葉中香氣前體物質含量來實現。

2.3.5 遮陰對酚酸（phenolic acids）的影響 有研究指出酚酸對茶葉的澀味和鮮味有重要影響，如KANEKO等[28,29]的研究表明茶沒食子素本身呈澀味，但是在滋味重組試驗中，茶沒食子素能極顯著的增強日本抹茶的鮮味。如表1和表2所示，中度遮陰處理后，沒食子酸、茶沒食子素、綠原酸、二沒食子酰葡萄糖苷的含量顯著上升，咖啡酰莽草酸的含量顯著降低，其他沒有顯著變化；黑暗遮陰處理后，沒食子酸、茶沒食子素等大部分酚酸的含量顯著上升，而咖啡酰莽草酸、魯米諾酸、3-O-p-香豆酰奎寧酸的含量顯著降低。酚酸與兒茶素類、黃酮（醇）糖苷等同屬于類黃酮代謝途徑，它們不同的變化趨勢預示遮陰對類黃酮代謝途徑的下游分支起著差異性調控。

2.3.6 遮陰對生物堿（alkaloids）和核苷（酸）（nucleosides and nucleotides）的影響 生物堿（咖啡堿、可可堿）是茶葉苦味的重要貢獻者，其含量隨著遮陰程度的增強而上升（表1和表2）。最近有報道認為核苷（酸）對茶葉滋味有一定的影響[17]，并具有諸多保健功效[30]，但遮陰顯著降低了腺嘌呤核苷二磷酸、腺嘌呤核苷磷酸、腺苷、鳥苷在鮮葉中的含量（表2），與YANG等[14]的研究結果相一致。核苷（酸）類物質是能量供應、RNA合成的重要前體，其含量的降低，或許是因為遮陰后光合作用減弱，導致整體代謝減弱所致。

此外，膽堿磷酸、1-乙基-5-羥基-2-吡咯烷酮的含量在中度遮陰后出現顯著上升，而甘油磷酸膽堿、N-乳酰乙醇胺、茶氨酸糖苷、泛酸的含量在遮陰后出現顯著下降，二氫獼猴桃內酯的含量在中度遮陰處理后顯著上升，而在黑暗遮陰處理后則顯著下降（表2）。

3 討論

3.1 葉綠體與游離氨基酸含量存在著緊密的聯系

研究發現中度遮陰處理可以加深茶葉的顏色，讓茶葉更綠，而黑暗遮陰處理則會導致茶葉綠色變淺，這與前人的研究結果一致[7,21]。一般來說，遮陰后茶葉的氨基酸含量會上升，但本研究中，中度遮陰處理反而降低了總氨基酸含量，黑暗遮陰處理使總氨基酸含量有所回升。氨基酸含量的上升有氨基酸生物合成加強和蛋白質水解增加兩條途徑。CHEN等[21]研究發現，遮陰（黑暗）處理后，游離氨基酸含量上升并非是由于氨基酸合成的增強，而是由于葉綠體蛋白的水解。在特異性茶樹品種‘安吉白茶’葉片白化時期，葉綠素含量降低，氨基酸含量上升，返綠后則出現相反變化[31]；進一步研究顯示，在白化時期，與光合磷酸化及葉綠體發育相關基因的表達發生顯著下調，而返綠后相關基因的表達又顯著上調[32]。此外，‘黃金芽’茶樹在遮陰后，葉片變綠，葉綠素含量上升，氨基酸含量降低，自然生長時則表現出相反的趨勢[33-34]。這些研究表明，葉綠體蛋白與游離氨基酸含量存在著此消彼長的關系。本研究中，中度遮陰處理后氨基酸含量的降低，很可能是因為其被利用合成了葉綠體蛋白，以結合更多的葉綠素，讓茶葉在低光照條件下提高光合效率；而黑暗遮陰處理后，茶樹葉片接收到的光強度劇烈降低，導致茶樹生物體所需的葉綠素量隨之下降，從而導致葉綠體中蛋白質降解，促使游離氨基酸含量相較于中度遮陰處理有所回升。

3.2 遮陰對茶葉碳氮代謝具有雙向性

本研究中，遮陰并沒有提高總氨基酸的含量，黑暗遮陰處理后總多酚含量反而出現了顯著上升。一般來說，遮陰會降低總多酚的含量，提升總氨基酸的含量。然而，也有少量研究與此相反。有研究顯示遮陰覆蓋會導致春茶的總多酚、粗纖維等的含量上升，總氨基酸含量的下降，而夏秋茶則表現出相反的結果[35]。在春茶采摘末期（4月26日至5月24日），40%遮光率+2.5 m遮蔭高度處理使茶葉總多酚含量和酚氨比上升，總氨基酸含量降低，導致茶湯濃厚、苦澀味加重[36]。在春季進行遮陰處理，會增強碳代謝的強度，相對削弱氮代謝的強度[37]，這可能是因為春季溫度不高、光照不強，遮陰導致光合作用強度不夠所致。本次研究中，總多酚含量的顯著上升，很大程度是由表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）含量的上升導致（表 1），LEE等[7]和李明等[38]也發現遮陰導致表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）含量的顯著增加。這些結果說明，遮陰對茶葉的碳氮代謝調控具有雙向性。光照與溫度有利于茶葉多酚的積累，而不利于氨基酸的積累。在夏秋季節，適當的遮陰會逆轉高溫、強光的作用，從而促使碳代謝向氮代謝轉變，降低酚氨比。本遮陰試驗中，因為遮陰時段為春季末期，且主要為陰雨、多云天氣，光照不強，溫度也不是很高，所以遮陰后，特別是黑暗遮陰后，會導致光照嚴重不足，從而相對加強茶樹的碳代謝，降低氮代謝，導致多酚含量顯著升高，氨基酸含量顯著降低。遮陰后，多酚含量上升，氨基酸含量下降的具體機制仍有待解析。

3.3 基于LC-MS的代謝組學方法具有強大的優勢

在本研究中，采用基于 LC-MS的代謝組學方法除了檢測到兒茶素類、氨基酸、生物堿等常規成分外，還鑒定到了一些常規分析方法難以檢測到的物質，如氨基酸中的哌啶酸、焦谷氨酸；核苷（酸）；兒茶素二聚體類；香氣糖苷等物質。這些物質均對茶葉品質具有重要影響，如有報道顯示焦谷氨酸對茶湯的鮮味具有重要作用[11]。因此，采用代謝組學技術研究遮陰對茶葉代謝的影響，可以更加全面地了解茶樹對光照調控的代謝應答和代謝產物的變化規律，以及遮陰對茶葉品質的影響。

4 結論

本文研究了遮陰對茶葉代謝及主要品質成分的影響，發現中度、黑暗遮陰降低了總氨基酸、黃酮含量，而黑暗遮陰增加了總多酚含量及酚氨比。此外，采用UHPLC-Q-TOF/MS詳細研究了遮陰對茶葉代謝的作用，總計鑒定得到了87個化合物，主要為氨基酸、兒茶素類及其二聚物、黃酮（醇）糖苷、香氣糖苷、酚酸等，其中82個化合物在遮陰后出現顯著性變化。遮陰對茶樹葉片的代謝調控是一個復雜的過程，對碳氮代謝具有雙向性，適當的遮陰可以提高茶葉品質，但黑暗遮陰則可能不利于提高茶葉的品質。

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