硫代腺苷甲硫氨酸促進番茄百菌清降解的生理機制

顧超珩，閆燕燕，魏夕雅，史慶華，鞏彪

（山東農業大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室/農業部黃淮海地區園藝作物生物學與種質創新重點實驗室，山東泰安 271018）

0 引言

【研究意義】櫻桃番茄（Lycopersicon esculentumvar.cerasiforme）是一類具有較高營養價值和獨特風味的鮮食番茄。其產業經濟效益高，栽培面積大，在我國發展迅速，甚至已經成為一些地區的農業支撐產業。但設施栽培條件下，櫻桃番茄易受各種病原菌侵染，引起葉霉病、灰霉病、早疫病、晚疫病和炭疽病等病害。作為生產中廣泛使用的廣譜性殺菌劑，百菌清（2,4,5,6-tetrachloroisophthalonitrile，chlorothalonil，CHT）常被應用于上述病害的化學防控，其用藥安全期為 25 d[1]。但櫻桃番茄生產多連續采摘，一旦用藥，將會導致后續產品農殘超標，影響經濟效益和人類健康。因此，研究番茄快速代謝農藥的技術及機制，對鮮食番茄安全生產具有重要意義。【前人研究進展】對于植物而言，農藥是一類異源有毒物質，施用過多會對植物造成毒害，引起生理、生化代謝異常，導致植株生長、發育受阻，產量、品質下降[2]。而植物在長期進化中形成了一套獨特的解毒系統，能夠轉化、分解對其生長和發育不利的異源化學物質；其解毒過程分為4個階段，也稱為4項代謝[3]：包括（I）細胞色素P450s和過氧化物酶體的氧化作用；（II）谷胱甘肽 S-轉移酶（GST）催化的谷胱甘肽共價結合反應；（III）ABC轉運蛋白介導的有毒物質區域化隔離；（IV）水解酶參與的降解反應。4項代謝中，前兩項代謝負責將有毒的大分子集團破壞，形成毒性低、移動性差的水溶性代謝產物；后兩項代謝負責將低毒小分子物質區域化并進一步水解[4]。由此可見，催化氧化反應和谷胱甘肽螯合反應是植物進行農藥代謝的關鍵步驟。前人研究表明，外源添加油菜素內酯[2]、一氧化氮[5]、胡敏酸[6]等均可促進植物農藥代謝。筆者研究發現，硫代腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase，SAMS）是控制硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）合成的關鍵酶，可對多種非生物脅迫產生響應[7]；且對鹽堿脅迫下番茄的活性氧（ROS）和谷胱甘肽代謝具有顯著的調控作用[8-9]。此外，SAM自1975年開始在歐洲作為抗憂郁和關節炎的處方藥投入使用；1999年，SAM首度以膳食補充劑的身份在美國推廣和發售[10]。【本研究切入點】推測 SAM可能參與調控包含農藥在內的異源有毒物質降解，但至今該研究領域尚屬空白。【擬解決的關鍵問題】擬通過研究外源 SAM對植物谷胱甘肽解毒途徑的影響，闡明SAM對番茄CHT代謝的作用效果及機理，探討一種可用于鮮食櫻桃番茄農藥降解的簡便方法，為蔬菜安全、綠色生產提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

試驗于2018年3—10月在山東農業大學作物生物學國家重點實驗室進行。

1.1 試驗設計

供試番茄品種為櫻桃番茄‘千禧’。采用常規育苗和栽培技術管理，待果實綠熟期時向果實表面按推薦劑量噴施CHT（75%可濕性粉劑，先正達生物科技有限公司）。2 d后，采用小型噴霧器將清水（Control）、0.1、0.5、1 和 2 μmol·L-1的 SAM 溶液均勻噴施于用藥番茄的表面，以剛能完全打濕果實表面作為處理標準，于農藥處理后2、5、10和15 d取番茄果實，測定CHT含量，以確定SAM的合理用量。ROS與谷胱甘肽代謝分析采用上述試驗材料與培養方法，設置對照（Control）、單獨施用CHT處理（CHT）和施用 CHT 并噴施 0.5 μmol·L-1的 SAM 處理（CHT+SAM）共計 3個處理，于農藥處理后 2、5、10和15 d后取番茄果實，對ROS及谷胱甘肽代謝相關指標進行測定。

1.2 測定方法

1.2.1 百菌清含量 取番茄果實樣品10 g，利用高速分散器磨碎，以80 mL 80℃的石油醚與40 g無水硫酸鈉浸提過夜，濾液經真空抽濾后，采用旋轉蒸發儀蒸發，以正己烷溶解，定容至5 mL，提取液經固相萃取柱凈化吸附，收集洗脫液用于色譜分析。氣相色譜檢測條件為：GC-ECD（Agilent Santa Clara, CA, USA）；色譜柱：30 m×0.32 mm，0.25 μm；載氣：氮氣；流速：3.3 mL·min-1；進樣口溫度：250℃；檢測器溫度：300℃；柱溫：以25℃·min-1的速度由80℃升至260℃，最終保持3.8 min[5]。

1.2.2 ROS和丙二醛（MDA）含量 采用磺胺比色法測定超氧陰離子（）含量[11]；四氯化鈦還原法測定過氧化氫（H2O2）含量[12]；硫代巴比妥酸法測定MDA含量[13]。

1.2.3 谷胱甘肽代謝酶活性 谷胱甘肽 S-轉移酶（GST）活性的測定參照李順欣等[14]的方法；谷胱甘肽還原酶（GR）活性的測定參照 FOYER和HALLIWELL[15]的方法；脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性的測定參照 NAKANO和 ASADA[16]的方法。

1.2.4 谷胱甘肽含量 采用GONG等[17]的方法測定還原型谷胱甘肽（GSH）含量和總谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量，計算氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量和谷胱甘肽還原氧化比（GSH/GSSG）。

1.3 數據處理

試驗處理及指標測定均執行3次生物學重復，數據采用Microsoft Excel 2007和SAS8.0統計軟件進行分析，采用最小差異差數法（LSD）進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

圖1 不同濃度SAM對番茄果實CHT含量的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of SAM on CHT contents of tomato fruits

2 結果

2.1 SAM對CHT的降解效果

圖1表明，果實表面噴施CHT后會產生CHT積累，且隨著時間的延長，CHT可被番茄果實自行降解，處理后15 d下降至噴藥2 d時的30.71%（P＜0.05）。與對照相比，外源噴施 0.1 μmol·L-1的 SAM 在 2—10 d內雖能降低番茄果實CHT含量，但差異不顯著（P＜0.05）；至 15 d 時，0.1 μmol·L-1SAM 處理組的 CHT含量才顯著低于對照（P＜0.05）。與對照相比，外源噴施0.5、1和 2 μmol·L-1的SAM 均可在5 d時顯著降低番茄果實CHT含量，其降低效果持續至15 d；但0.5、1和2 μmol·L-1SAM處理組之間的CHT含量差異不顯著（P＜0.05）。因此，0.5 μmol·L-1的 SAM 可作為番茄 CHT降解的有效處理組用于后續試驗，其CHT殘留量在處理后5、10和15 d較同時期對照組分別下降了33.72%、52.87 %和63.75 %。

2.2 SAM對ROS代謝的影響

圖 2 CHT 和 CHT+SAM 對番茄果實 O2?-、H2O2和 MDA 含量的影響Fig. 2 Effects of CHT and CHT+SAM on contents of, H2O2 and MDA of tomato fruits

鑒于 ROS在參與植物降解農藥的氧化過程中發揮重要作用，本研究先就SAM和CHT對ROS含量的影響進行分析（圖2）。結果表明，番茄果實的含量于噴施CHT 2 d時顯著高于對照，其余處理時段與對照差異不顯著（P＜0.05）；H2O2含量于噴施CHT 2 d和5 d時顯著高于對照，其余處理時段與對照差異不顯著（P＜0.05）；而MDA含量在噴施CHT的各處理時段下均與對照差異不顯著（P＜0.05）。說明噴施CHT可在短期內引起番茄的氧化應激反應，但這種氧化應激并不足以造成細胞損傷。而 CHT+SAM處理下第5天的和 H2O2含量顯著高于 CHT處理；CHT+SAM處理下第10天的和 H2O2含量略高于CHT處理，但顯著高于對照（P＜0.05）。不同時期各處理組間的 MDA含量差異不顯著（P＜0.05）。說明CHT+SAM處理在沒有造成氧化傷害的情況下，較 CHT處理更強烈且更持久的引起細胞內氧化應激反應。

2.3 SAM對谷胱甘肽代謝的影響

谷胱甘肽循環是植物應對脅迫和解毒的關鍵代謝途徑，主要涉及GSH和GSSG之間的轉換與利用，而GR和DHAR則是控制GSSG再生成GSH的關鍵酶。與對照相比，CHT處理可在各時期內增強GR與DHAR的活性；CHT處理下的GR和DHAR活性與對照間的差距均呈現先增后減的趨勢，于處理后 5 d達到最大（圖3）。說明CHT處理可激活GR和DHAR，提高谷胱甘肽循環效率。CHT+SAM處理下第5天和第10天的GR和DHAR活性顯著高于CHT處理，而第15天的GR和DHAR活性顯著低于CHT處理（P＜0.05）；但各時期內CHT+SAM處理下的GR和DHAR活性均顯著高于對照（P＜0.05）（圖3）。說明CHT+SAM處理較CHT處理能更有效的在農藥降解早期激活GR和DHAR活性。

圖4顯示，GSH含量在CHT處理2—10 d時顯著高于對照，至15 d時與對照差異不顯著（P＜0.05）；而CHT+SAM處理5—15 d時的GSH含量顯著高于對照及 CHT處理（P＜0.05）。GSSG含量在 CHT處理2—10 d時顯著高于對照，至15 d時與對照差異不顯著（P＜0.05）；但 CHT+SAM 處理 2—5 d時的 GSSG含量與 CHT處理差異不顯著，至處理10—15 d時顯著低于 CHT處理（P＜0.05）。GSH+GSSG在CHT處理2—10 d時顯著高于對照，至 15 d時與對照差異不顯著（P＜0.05）；而CHT+SAM處理5 d時的GSH+GSSG顯著高于CHT處理，其余處理時段與 CHT處理差異不顯著（P＜0.05）。GSH/GSSG在CHT處理2—5 d時顯著高于對照，至10—15 d時顯著低于對照（P＜0.05）；但CHT+SAM處理5—15 d時的GSH/GSSG均顯著高于對照及CHT處理（P＜0.05）。說明CHT處理能促進谷胱甘肽的從頭合成，提高GSH的還原效率，而SAM主要從提高GSH還原效率層面調控谷胱甘肽代謝以適應番茄的農藥降解需求。

圖3 CHT和CHT+SAM對番茄果實GR和DHAR活性的影響Fig. 3 Effects of CHT and CHT+SAM on activities of GR and DHAR of tomato fruits

圖4 CHT和CHT+SAM對番茄果實GSH、GSSG、GSH+GSSG和GSH/GSSG的影響Fig. 4 Effects of CHT and CHT+SAM on contents of GSH, GSSG, GSH+GSSG and GSH/GSSG of tomato fruits

2.4 SAM對農藥降解關鍵酶GST活性的影響

GST是生物體針對各類有毒物質進行解毒的關鍵酶。圖5顯示，GST活性在CHT處理2—10 d時顯著高于對照（P＜0.05），至15 d時略高于對照，其在處理后第5天達到峰值。說明GST是CHT代謝響應的關鍵酶之一。而CHT+SAM處理5—10 d時的GST活性顯著高于CHT處理（P＜0.05），但CHT+SAM處理 15 d時的 GST活性顯著低于 CHT處理（P＜0.05），略低于對照。說明CHT+SAM處理較CHT處理能更有效的在農藥降解早期激活GST活性。

3 討論

SAM是蛋氨酸循環的中間產物，其在動物、植物和微生物中的代謝通路相對保守。除了參與蛋氨酸循環外，SAM還參與了轉甲基、轉氨丙基、轉硫等多種生理作用，從而影響谷胱甘肽、煙酰胺、多胺和乙烯等多類信號物質的代謝反應[18]。筆者前期研究發現，SAMS1可受多種逆境誘導，促進SAM合成，以幫助植物應對受脅迫造成的傷害[7-8,19]。本研究表明，外源添加0.5 μmol·L-1的SAM即可顯著激活番茄的谷胱甘肽解毒系統，促進農藥降解。說明 SAM 并非作為能量代謝物質，而是通過擔當信號分子調控番茄的農藥解毒過程。

圖5 CHT和CHT+SAM對番茄果實GST活性的影響Fig. 5 Effects of CHT and CHT+SAM on GST activity of tomato fruits

植物進行農藥代謝的第一步反應是借助細胞內的氧化力對農藥分子中不穩定的化學鍵進行氧化修飾，其主要涉及細胞色素 P450s。作為植物最大的基因家族，目前已有5 100多個細胞色素P450s基因被注釋[20]。ZHOU等[2]借助轉錄組測序技術在番茄中鑒定到2個受CHT誘導的細胞色素基因P450（基因ID：AI776109和 BF112381），但更為深入的遺傳驗證工作尚未開展。由于細胞色素P450s基因家族過于龐大，科學家至今未能確定植物農藥代謝過程中的關鍵細胞色素基因P450s。但細胞色素P450介導的氧化修飾過程需要細胞內有足夠的氧化性物質來提供氧化力，故本研究分析了CHT與CHT+SAM對和H2O2的含量的影響。發現外源添加0.5 μmol·L-1的SAM可在沒有造成細胞氧化傷害的情況下引起細胞內氧化應激反應（圖2）。SAM是生物體內多胺和乙烯的共同合成前體[18]。筆者前期研究發現，超表達SAMS1[8]或外源添加SAM[9]均可誘導番茄內源多胺和乙烯含量的增加。多胺的積累會激活多胺氧化酶活性，促進多胺降解，釋放出反應副產物—H2O2[9]；另外，乙烯信號代謝通路往往也涉及 ROS爆發[21]，這可能是本研究中外源SAM能進一步誘導ROS的主要原因。綜上所述，在對照處理下，番茄細胞的 ROS產生和消除處于平衡態；CHT造成的輕度脅迫可引起ROS產量增加，激活植物的系統性防御反應[22]，協同細胞色素 P450促進CHT的氧化降解；外源添加SAM可能從多胺和乙烯代謝通路上協同增強ROS信號介導的防御反應，進一步促進CHT的氧化降解。但無論是CHT處理還是CHT+SAM處理，其細胞內的ROS積累均未超越抗氧化系統的清除能力，故本研究中MDA含量在不同處理間并未產生顯著差異。但隨著處理時間的延長，、H2O2和MDA含量均呈現上升趨勢，這可能是由于番茄在成熟過程中呼吸速率增加，造成的ROS積累和細胞膜系統降解所致。

SAM經過轉甲基、水解和轉硫作用生成半胱氨酸（Cys），Cys在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的催化下經γ-谷氨酰半胱氨酸生成 GSH[18]。這可能是本研究中CHT+SAM 處理的 GSH含量和谷胱甘肽總量均高于CHT處理的原因之一。另外，在番茄[8-9]和苜蓿[23]中超表達SAMS1均能通過激活GR和DHAR活性，促進GSSG向GSH轉換，增加谷胱甘肽還原氧化比。這與本研究中外源 SAM 對谷胱甘肽代謝的影響相吻合。在植物中，GSH一方面能夠減少由于環境和代謝產物脅迫而引發的ROS積累，消除ROS對植物機體的傷害作用；另一方面，GSH又能夠在GST的催化作用下與異源有毒物質結合，促進有害物質的區域化降解[24-25]。本研究中GSH含量與和H2O2含量的變化趨勢相一致，說明SAM通過誘導ROS積累，激活了GSH的從頭合成和再生，增加了谷胱甘肽還原氧化比，使得更多的GSH可以用于GST介導的農藥代謝過程。此外，大量研究表明，多胺[26-28]和乙烯[29-30]信號對谷胱甘肽代謝也存在顯著的激活作用，這可能是外源SAM促進谷胱甘肽代謝的間接調控途徑。

4 結論

硫代腺苷甲硫氨酸作為一種對人類和環境無害的天然生物代謝物質，可通過激活活性氧和谷胱甘肽代謝途徑，促進番茄對百菌清的降解。基于ROS和谷胱甘肽在植物解毒途徑中功能的保守性，推測硫代腺苷甲硫氨酸可延伸應用于其他作物中的農藥代謝降解，但其相關研究仍需后續試驗驗證。研究結果為硫代腺苷甲硫氨酸在蔬菜綠色生產和農藥化控降解技術應用的研究領域奠定了一定的理論基礎。

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