10%乙霉威·腐霉利微粉劑的研制及其對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果

揣紅運(yùn)，石延霞，柴阿麗，楊杰，謝學(xué)文，李寶聚

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京100081；2西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，拉薩850032）

0 引言

【研究意義】由多主棒孢（Corynespora cassiicola）引起的黃瓜棒孢葉斑病是一種世界性分布的重要植物真菌病害，一般田間葉片發(fā)病率為10%—25%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%，甚至100%[1]。隨著設(shè)施黃瓜的大量種植，棚室內(nèi)高溫高濕的小氣候環(huán)境十分有利于黃瓜棒孢葉斑病的發(fā)生與流行，使得棒孢葉斑病逐漸發(fā)展成為危害我國黃瓜生產(chǎn)的主要病害之一[2]，目前化學(xué)防治是控制該病最有效的手段。保護(hù)性殺菌劑在發(fā)病前使用，防治效果相對(duì)較差，治療性殺菌劑防治效果較好，但作用位點(diǎn)單一，病原菌的抗藥性問題不容忽視[3]。乙霉威（diethofencarb）和腐霉利（procymidone）為對(duì)多主棒孢具有較高抑菌活性的內(nèi)吸性殺菌劑[4]，盡管目前有研究報(bào)道多主棒孢對(duì)乙霉威產(chǎn)生抗藥性，但是抗性頻率較低，且該藥劑與苯并咪唑類殺菌劑具有負(fù)交互抗藥性[5]，腐霉利作用位點(diǎn)單一，屬于高抗藥性風(fēng)險(xiǎn)藥劑[4]。因此將乙霉威和腐霉利混配加工成具有粒徑小，分散性好，流動(dòng)性強(qiáng)，貯存穩(wěn)定，農(nóng)藥利用率高且施藥不需兌水等優(yōu)點(diǎn)的微粉劑[6]，并明確其對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果，對(duì)于更好地防治黃瓜棒孢葉斑病及延長(zhǎng)這2種藥劑的使用壽命和降低田間苯并咪唑類殺菌劑抗性的產(chǎn)生具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】乙霉威是由日本住友公司在1984年開發(fā)的一種苯氨基甲酸酯類內(nèi)吸性殺菌劑，廣泛應(yīng)用于多種蔬菜病害的防治，具有較強(qiáng)的保護(hù)和治療效果[7]，其作用機(jī)理是通過與菌體細(xì)胞的微管蛋白相結(jié)合，進(jìn)而抑制細(xì)胞分裂，使菌體死亡。HASAMA等[8]研究表明，乙霉威能夠明顯降低田間棒孢葉斑病的發(fā)生，且具有明顯增產(chǎn)效應(yīng)。但是近年來，黃大野[4]對(duì)浙江、遼寧、河北、北京、海南、內(nèi)蒙古等地區(qū)的163個(gè)多主棒孢菌株研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)乙霉威抗性頻率達(dá)11%。腐霉利是由德國巴斯夫公司開發(fā)生產(chǎn)的一種二甲酰亞胺類內(nèi)吸性殺菌劑，該藥劑對(duì)孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)均具有較高的抑制作用，已被廣泛地用于控制多主棒孢、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、核盤菌（Sclerotiniaspp.）和鏈格孢菌（Alternariaspp.）等引起的植物真菌病害[3]。該類藥劑的作用機(jī)制尚不明確，推測(cè)可能是干擾滲透壓上組氨酸激酶和活化蛋白激酶而呈現(xiàn)抗菌活性[9]。諶江華等[10]研究表明，腐霉利單獨(dú)使用極易誘發(fā)病原菌產(chǎn)生抗藥性。微粉劑是在吸油率高的礦物微粉和黏土微粉所組成的填料中加入原藥、助劑混合后，再經(jīng)氣流粉碎機(jī)粉碎到10 μm以下的一種粉劑。撒布時(shí)粒子不凝集，以單一顆粒在空中浮游、擴(kuò)散，然后均勻地附著于植株各個(gè)部位，因而防治效果較好[11]。目前，我國有關(guān)農(nóng)藥微粉劑的研究較少，粉塵劑、可濕性粉劑的報(bào)道較多，秦寶福[11]通過單因素試驗(yàn)確定了苦皮藤素微粉劑的最佳載體為高嶺土，助劑為萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物（NNO）；趙衛(wèi)松等[12]通過單因素試驗(yàn)確定了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）粉塵劑的最佳配方為滑石粉20%、分散劑GY-D900 2%、菌株BAB-1原藥補(bǔ)足至100%；李姝江等[13]通過正交試驗(yàn)確定了解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）可濕性粉劑的最佳配方。正交試驗(yàn)是研究多因素多水平的一種設(shè)計(jì)方法，能提高劑型配方篩選的科學(xué)性。日本農(nóng)藥學(xué)會(huì)[6]通過試驗(yàn)研究篩選出微粉劑的最佳配方，結(jié)果表明加入一定量的分散劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑，能提高微粉顆粒在植株葉片上的附著效應(yīng)，降低農(nóng)藥分解效率，顯著提高農(nóng)藥的有效利用率。【本研究切入點(diǎn)】農(nóng)藥復(fù)配是病原菌抗性治理的有效途徑，目前還未見 10%乙霉威·腐霉利微粉劑的研制及其對(duì)黃瓜棒孢葉斑病田間防治效果的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】測(cè)定乙霉威和腐霉利不同比例混合物對(duì)多菌靈/乙霉威雙高抗菌株、多菌靈高抗乙霉威敏感菌株以及多菌靈敏感乙霉威高抗菌株的毒力，確定其增效作用最佳組合，通過載體、助劑的篩選，采用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)等方法制備穩(wěn)定的10%乙霉威·腐霉利微粉劑，并通過藥效試驗(yàn)探究其對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2016—2018年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所完成。

1.1 供試材料

菌株：供試多主棒孢菌株 HG09112606（對(duì)多菌靈高抗，對(duì)乙霉威敏感）、FQ07091401（對(duì)多菌靈敏感，對(duì)乙霉威高抗）、HG11011509（對(duì)多菌靈、乙霉威雙高抗）[4]，保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所菜病綜防組 4℃冰箱馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基。

儀器：GYF-100氣流粉碎機(jī)（昆山密友粉碎設(shè)備有限公司）；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；GCMS-TQ8040三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津有限公司）；PL203分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；BT-9300Z激光粒度分析測(cè)定儀（丹東市百特儀器有限公司）；IKA研磨機(jī)（艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司）；XB-K-25血球計(jì)數(shù)板（北京普益華科技有限公司）；3FB-03-AE-1精量電動(dòng)彌粉機(jī)（中農(nóng)豐茂植保機(jī)械有限公司）；3WBD-16背負(fù)式電動(dòng)噴霧器（青島至信永成商貿(mào)有限公司）；自制超微量葉面噴霧器。

供試藥劑：98.5%腐霉利原藥，江西禾益化工股份有限公司；95%乙霉威原藥，江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司；10%乙霉威·腐霉利可濕性粉劑，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所自主研制；43%氟菌·肟菌酯（fluopyram·trifloxystrobin）懸浮劑，拜耳股份公司；35%苯甲·咪鮮胺（difenoconazole·prochloraz）水乳劑，山東省青島瀚生生物科技股份有限公司。

供試載體及助劑：硅藻土、白炭黑、膨潤(rùn)土、煅燒高嶺土、凹凸棒土、滑石粉，均由河北石家莊靈壽縣天昊礦產(chǎn)品加工廠提供；萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物（formaldehyde condensates of sodium naphthalene sulfonate salt，NNO）、萘磺酸鹽類（naphthalene sulfonate，D10）、聚羧酸鹽類（carboxylates，T36）等分散劑均由南京捷潤(rùn)科技有限公司提供；烷基萘磺酸鹽（alkyl naphthalene sulfonate，Morwet EFW）、木質(zhì)素磺酸鹽（lignosulfonate，DM02）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，K12）等表面活性劑均由南京捷潤(rùn)科技有限公司提供；聚氧乙烯烷基醚（polyoxyethylene alkyl ether）、聚氧乙烯芳基硫酸鹽（polyoxyethylene aryl sulfate）、聚氧乙烯脂肪酸酯（polyoxyethylene fatty acid ester）等穩(wěn)定劑均由南京捷潤(rùn)科技有限公司提供。

供試植物及培養(yǎng)基：黃瓜品種為易感病的中農(nóng) 6號(hào)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供，待黃瓜植株長(zhǎng)至2—4片真葉時(shí)，供室內(nèi)盆栽試驗(yàn)測(cè)定。待黃瓜植株長(zhǎng)至10片真葉時(shí)，供田間試驗(yàn)測(cè)定。PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 L蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 菌絲生長(zhǎng)速率法篩選最佳藥劑組合 采用菌絲生長(zhǎng)速率法篩選最佳藥劑組合[14]。將乙霉威和腐霉利原藥用少量丙酮溶劑溶解后，用無菌水分別配制成質(zhì)量濃度為1×104μg·mL-1的母液，按不同質(zhì)量比（9﹕1、8﹕2、7﹕3、6﹕4、5﹕5、4﹕6、3﹕7、2﹕8、1﹕9）混合，得到不同配比的混合液。再用無菌水將各單劑及混劑稀釋成質(zhì)量濃度為1 000、100、10、1、0.1、0.01 μg·mL-1的藥液，分別與 PDA 培養(yǎng)基按體積比1﹕9的比例混合，制成含藥量分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001 μg·mL-1的 PDA 平板。在無菌條件下，用打孔器將預(yù)培養(yǎng)5 d的多主棒孢菌株沿菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，菌絲面向下接種到含系列濃度的乙霉威·腐霉利PDA平板中央。每個(gè)處理4次重復(fù)，并設(shè)空白和溶劑對(duì)照。28℃黑暗培養(yǎng)5 d后，測(cè)量菌落直徑，建立回歸方程，并計(jì)算EC50。根據(jù)Wadley公式[15]計(jì)算增效系數(shù)（SR），確定最佳混配比例。EC50（th）=（a+b）/[a/EC50（A）+b/EC50（B）]；SR=EC50（th）/EC50（ob）。式中，A、B為單劑，a、b為相應(yīng)單劑在混劑中的比例，ob為實(shí)際觀察值，th為理論值。SR＞1.5為增效作用；0.5≤SR≤1.5為相加作用；SR＜0.5為拮抗作用。

1.2.2 單因素試驗(yàn)篩選載體與助劑 載體篩選體系為10 g。分別稱取90%的硅藻土、白炭黑、膨潤(rùn)土、煅燒高嶺土等載體（9 g），每種載體中加入10%（1 g）乙霉威·腐霉利原藥（按照篩選出的最佳混配比例稱取）經(jīng)研磨機(jī)混合均勻，即制得有效成分為10%的乙霉威·腐霉利制劑。助劑篩選體系為 10 g。分別稱取90%的萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物（NNO）、萘磺酸鹽類（D10）、聚羧酸鹽類（T36）分散劑（9 g），每種分散劑中加入 10%（1 g）的乙霉威·腐霉利原藥經(jīng)研磨機(jī)混合均勻，即制得不同制劑；分別稱取90%的烷基萘磺酸鹽（Morwet EFW）、木質(zhì)素磺酸鹽（DM02）、十二烷基硫酸鈉（K12）表面活性劑（9 g），每種表面活性劑中加入 10%（1 g）的乙霉威·腐霉利原藥經(jīng)研磨機(jī)混合均勻，即制得不同制劑；分別稱取90%的聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯芳基硫酸鹽、聚氧乙烯脂肪酸酯穩(wěn)定劑（9 g），每種穩(wěn)定劑中加入10%（1 g）的乙霉威·腐霉利原藥經(jīng)研磨機(jī)混合均勻，即制得不同制劑。每個(gè)處理重復(fù)4次。比較各個(gè)不同制劑的分散性、浮游性、穩(wěn)定性、吸附性[16]等因素，確定最優(yōu)載體和助劑。

1.2.3 正交試驗(yàn)確定載體、助劑的最佳配比 利用初篩的載體和助劑進(jìn)行正交試驗(yàn)[17]，分別檢測(cè)分散指數(shù)、浮游性指數(shù)、坡度角確定其各組分的最優(yōu)配比含量。設(shè)計(jì)采用4因素3水平正交試驗(yàn)[L9(34)]，即載體含量分別為15%、20%、25%；分散劑含量分別為2%、3%、4%；表面活性劑含量分別為 2%、3%、4%；穩(wěn)定劑含量分別為0.5%、1%、1.5%。

1.2.4 樣品的加工與性能指標(biāo)的測(cè)定[18]按照本研究的篩選結(jié)果，稱取一定量的有效成分為95%乙霉威原藥和 98.5%腐霉利原藥、載體、分散劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑加入研磨機(jī)中研磨 1 min，再經(jīng)氣流粉碎機(jī)超微粉碎制成微粉劑。

樣品加工后熱貯穩(wěn)定性測(cè)定（GB/T 19136—2003）：將5 g 10%乙霉威·腐霉利微粉劑加入到潔凈的安瓿瓶中，用酒精噴燈進(jìn)行封口，封口后分別稱重。稱重后將封好的安瓿瓶置于 GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱中，（54±2）℃貯存，14 d后取出安瓿瓶，稱重測(cè)量。質(zhì)量未發(fā)生變化的試樣，于24 h內(nèi)對(duì)其進(jìn)行有效成分含量測(cè)定，計(jì)算分解率，試驗(yàn)重復(fù)4次。

有效成分含量測(cè)定：準(zhǔn)確稱取有效成分為 0.1 g乙霉威、腐霉利標(biāo)準(zhǔn)品（乙霉威、腐霉利按照篩選出的最佳混配比例混配），于50 mL離心管中，用丙酮溶劑定容至20 mL，用蒸餾水稀釋濃度至50 μg·mL-1，待測(cè)；分別準(zhǔn)確稱取 10%乙霉威·腐霉利微粉劑熱貯前及熱貯后試樣1 g，于50 mL離心管中，用丙酮溶劑定容至20 mL，用蒸餾水稀釋濃度至50 μg·mL-1，待測(cè)。分解率=（有效成分原始含量-熱貯后有效成分含量）/有效成分原始含量×100%。氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀測(cè)定條件為柱箱溫度：40.0℃；進(jìn)樣口溫度：65.0℃；進(jìn)樣方式：分流；載氣：He；總流量：26.0 mL·min-1；柱流量：1.0 mL·min-1；線速度：36.1 cm·s-1；離子源溫度：250.0℃；接口溫度：280.0℃；溶劑延遲時(shí)間6.0 min。

分散指數(shù)測(cè)定：準(zhǔn)確稱取定量混合均勻的樣品后，采用干篩法過篩，鋪平到分散器底部，接通電源并開始計(jì)時(shí)，30 s后停止，稱取分散后殘余粉體質(zhì)量，分散指數(shù)=（樣品量-殘余樣品量）/樣品量×100%，試驗(yàn)重復(fù)5次。

浮游性指數(shù)測(cè)定：將混合均勻的樣品在散粉箱內(nèi)散粉30 s后，再將浮游在箱內(nèi)的粗微粒子捕集到盛水的集塵管內(nèi)，在波長(zhǎng)610 nm處測(cè)定透光率，浮游性指數(shù)=100-透光率。

流動(dòng)性測(cè)定：采用坡度角測(cè)定方法，將試料通過篩網(wǎng)孔徑約0.5 mm、直徑30 mm的小篩，加入下口內(nèi)徑5 mm的漏斗中，漏斗下口對(duì)準(zhǔn)直徑2 cm的小圓片，使試樣均勻加到圓片上堆成小圓錐體，當(dāng)錐體高度不再增加時(shí)，停止加料，由用作外罩的玻璃管壁上的標(biāo)尺觀察椎體的高度，重復(fù)測(cè)定 5次，求平均值。計(jì)算公式：tanθ= H/1.0。式中，H為錐體高度（cm）。

含水率測(cè)定：按照GB/T 1600—1989農(nóng)藥水分的測(cè)定方法中的共沸蒸餾法進(jìn)行。

粒徑測(cè)定：按照GB/T 16150—1995農(nóng)藥粉劑、可濕性粉劑細(xì)度測(cè)定方法中的干篩法進(jìn)行。

1.2.5 10%乙霉威·腐霉利微粉劑室內(nèi)盆栽藥效試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所玻璃溫室進(jìn)行盆栽防治效果測(cè)定試驗(yàn)。共設(shè)9個(gè)藥劑處理：10%乙霉威·腐霉利微粉劑噴粉處理，施藥劑量分別為100、150 g a.i./hm2；10%乙霉威·腐霉利微粉劑噴霧處理，施藥劑量分別為 100 g a.i./hm2（0.0035 g a.i./株）、150 g a.i./hm2（0.005 g a.i./株）；10%乙霉威·腐霉利可濕性粉劑噴霧處理，施藥劑量分別為100 g a.i./hm2（0.0035 g a.i./株）、150 g a.i./hm2（0.005 g a.i./株）；35%苯甲·咪鮮胺水乳劑噴霧處理，施藥劑量為 300 g a.i./hm2（0.01 g a.i./株）；43%氟菌·肟菌酯懸浮劑噴霧處理，施藥劑量為90 g a.i./hm2（0.003 g a.i./株）；空白對(duì)照噴施清水。噴粉處理使用精量電動(dòng)彌粉機(jī)[19]，噴霧處理使用微量噴霧器。每個(gè)處理4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20株黃瓜苗。在施藥前，將噴粉處理的黃瓜苗放置到一個(gè)密閉的玻璃溫室中以防止微粉飄散，噴粉結(jié)束 4 h后，將噴粉處理的黃瓜苗與噴霧處理的黃瓜苗放置一起，以保證整個(gè)環(huán)境條件一致。

將多主棒孢菌株HG11011509在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d，用毛刷將孢子刷下，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)配，獲得 1×105孢子/mL懸浮液。待盆栽黃瓜苗長(zhǎng)至 2—4片真葉時(shí)采用葉面噴霧的方式接種多主棒孢孢子懸浮液（保證黃瓜植株所有葉片上孢子懸浮液分布均勻），接菌后將黃瓜苗放在相對(duì)濕度為90%，溫度28℃保濕柜中保濕培養(yǎng)24 h，接種24 h后進(jìn)行藥劑處理，同時(shí)轉(zhuǎn)入正常育苗溫室培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后空白對(duì)照充分發(fā)病，然后進(jìn)行病情指數(shù)調(diào)查并計(jì)算防治效果。每個(gè)處理調(diào)查80株黃瓜苗，每株黃瓜苗調(diào)查全部葉片。黃瓜棒孢葉斑病病情指數(shù)調(diào)查按如下標(biāo)準(zhǔn)[20]：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積5%以下；3級(jí)，病斑面積5%—25%；5級(jí)，病斑面積26%—50%；7級(jí)，病斑面積51%—75%；9級(jí)，病斑面積75%以上。病情指數(shù)=∑（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）×100；防治效果=（CK-PT）/CK×100%。式中，CK為空白對(duì)照區(qū)施藥后病情指數(shù)；PT為藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)。

1.2.6 10%乙霉威·腐霉利微粉劑田間藥效試驗(yàn) 參考《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)，于2018年12月在山東壽光日光溫室進(jìn)行。黃瓜棒孢葉斑病為人工接種：待黃瓜植株長(zhǎng)至10片真葉時(shí)，采用葉面噴霧的方式接種1×105孢子/mL的多主棒孢菌株HG11011509孢子懸浮液（保證黃瓜植株所有葉片上孢子懸浮液分布均勻），24 h后再進(jìn)行藥劑處理。試驗(yàn)共設(shè)9個(gè)藥劑處理：10%乙霉威·腐霉利微粉劑噴粉處理，施藥劑量分別為100、150 g a.i./hm2；10%乙霉威·腐霉利微粉劑噴霧處理，施藥劑量分別為100、150 g a.i./hm2（用水量 750 L·hm-2）；10%乙霉威·腐霉利可濕性粉劑噴霧處理，施藥劑量分別為 100、150 g a.i./hm2（用水量 750 L·hm-2）；35%苯甲·咪鮮胺水乳劑噴霧處理，施藥劑量為300 g a.i./hm2（用水量750 L·hm-2）；43%氟菌·肟菌酯懸浮劑噴霧處理，施藥劑量為90 g a.i./hm2（用水量750 L·hm-2）；空白對(duì)照噴施清水。噴粉處理使用精量電動(dòng)彌粉機(jī)，噴霧處理使用背負(fù)式電動(dòng)噴霧器。采用隨機(jī)區(qū)組排列，4次重復(fù)，共36個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為29 m2，用塑料薄膜縱向分割溫室大棚形成小區(qū)，以保證每個(gè)棚室的密封效果。每隔7 d施藥一次，共施藥3次，于第3次施藥后7 d調(diào)查病情指數(shù)并計(jì)算防治效果，每小區(qū)對(duì)角線5點(diǎn)取樣調(diào)查，每點(diǎn)調(diào)查2株，每株調(diào)查全部葉片。病情指數(shù)調(diào)查及防治效果計(jì)算同1.2.5。

2 結(jié)果

2.1 不同混配比例對(duì)多主棒孢的毒力增效

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定乙霉威與腐霉利以不同比例混配對(duì)多主棒孢的聯(lián)合毒力，結(jié)果表明乙霉威與腐霉利大多數(shù)比例混合物對(duì)菌株 HG09112606、FQ07091401具有增效作用，其中當(dāng)乙霉威與腐霉利以1﹕1混配時(shí)增效作用最明顯，增效系數(shù)分別為 3.19和2.53；當(dāng)乙霉威與腐霉利以1﹕1和1﹕4混配時(shí)對(duì)菌株HG11011509有增效作用，增效系數(shù)分別為1.68和1.98。綜合考慮3個(gè)供試菌株的增效程度及用藥成本，選定1﹕1作為乙霉威與腐霉利最佳混配比例進(jìn)行制劑及田間藥效研究（圖1）。

2.2 不同載體、助劑的篩選

2.2.1 載體的篩選 基于單因素試驗(yàn)測(cè)定 6種不同載體對(duì)10%乙霉威·腐霉利制劑的影響。白炭黑分散指數(shù)大，坡度角小，分別為 91.16%，67°，但浮游性指數(shù)較小，為60.67；硅藻土分散指數(shù)較小，為85.85%，但浮游性指數(shù)大，為78.11，坡度角為69°。綜合考慮各制劑的分散指數(shù)、浮游性指數(shù)、坡度角等因素，確定最優(yōu)載體為白炭黑和硅藻土（表1）。

2.2.2 助劑的篩選 3種常見的分散劑對(duì) 10%乙霉威·腐霉利制劑有不同程度的影響，其中萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物（NNO）分散指數(shù)最大，分散性最強(qiáng)，與其他兩種分散劑具有顯著性差異（P＜0.05）；3種表面活性劑對(duì) 10%乙霉威·腐霉利制劑同樣具有不同程度的影響，其中十二烷基硫酸鈉（K12）吸附時(shí)間最短，吸附能力最強(qiáng)，與其他兩種表面活性劑具有顯著性差異（P＜0.05）；常見的3種穩(wěn)定劑對(duì)10%乙霉威·腐霉利制劑有不同程度的影響，其中聚氧乙烯烷基醚分解率最小，穩(wěn)定性最強(qiáng)，與其他兩種穩(wěn)定劑具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，分散劑萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物（NNO）、表面活性劑十二烷基硫酸鈉（K12）及穩(wěn)定劑聚氧乙烯烷基醚可作為配方中的有效組分進(jìn)行最佳配比的優(yōu)化（圖2）。

圖1 乙霉威和腐霉利混配對(duì)多主棒孢的毒力增效作用Fig. 1 Synergistic interactions of diethofencarb·procymidone mixtures against mycelial growth of C. cassiicola

表1 不同載體對(duì)10%乙霉威·腐霉利混配制劑的影響Table 1 The effect of different carriers on the mixture of 10% diethofencarb·procymidone

2.3 載體、助劑最佳配比的確定

綜合考慮白炭黑和硅藻土兩種載體的分散性、浮游性、流動(dòng)性等因素，選取載體白炭黑進(jìn)行配比的優(yōu)化，載體硅藻土補(bǔ)足至 100%。不同組成成分對(duì)于制劑的分散性、浮游性、流動(dòng)性有不同程度的影響。其中對(duì)10%乙霉威·腐霉利制劑分散指數(shù)影響順序?yàn)榘滋亢冢痉稚颈砻婊钚詣痉€(wěn)定劑；對(duì) 10%乙霉威·腐霉利制劑浮游性指數(shù)影響順序?yàn)榘滋亢冢痉稚颈砻婊钚詣痉€(wěn)定劑；對(duì)10%乙霉威·腐霉利制劑坡度角影響順序?yàn)榘滋亢冢痉€(wěn)定劑＞分散劑＞表面活性劑。粉劑的分散指數(shù)大，則粒子間凝聚力小，易分散；浮游性指數(shù)大，粉劑易漂移；坡度角小，粉劑流動(dòng)性強(qiáng)。因此，將此 3種因素作為衡量粉劑載體與助劑最佳配比的重要指標(biāo)。由表2可知，分散指數(shù)大、浮游性指數(shù)大、坡度角小的組分為第2組，確定最佳配比為載體白炭黑 15%，分散劑萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物（NNO）3%，表面活性劑十二烷基硫酸鈉（K12）3%，穩(wěn)定劑聚氧乙烯烷基醚1%，載體硅藻土補(bǔ)足至100%。

2.4 樣品的加工與性能指標(biāo)測(cè)定

2.4.1 樣品的加工 通過載體、助劑的篩選，確定了10%乙霉威·腐霉利微粉劑最佳配方為乙霉威·腐霉利原藥10%，載體白炭黑15%，分散劑萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物（NNO）3%，表面活性劑十二烷基硫酸鈉（K12）3%，穩(wěn)定劑聚氧乙烯烷基醚1%，載體硅藻土補(bǔ)足至100%。

2.4.2 熱貯穩(wěn)定性測(cè)定 熱貯后 10%乙霉威·腐霉利微粉劑沒有結(jié)塊現(xiàn)象。經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀檢測(cè)未熱貯標(biāo)樣有效成分含量為 9.22%，54℃熱貯后有效成分含量為8.84%，分解率為4.12%，符合標(biāo)準(zhǔn)（表3）。

表2 載體和助劑配比優(yōu)化的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Proportioning optimization result of the carriers and additives in orthogonal test

2.4.3 其他性能指標(biāo)測(cè)定 參照中華人民共和國農(nóng)藥粉劑及凌世海[18]農(nóng)藥劑型加工相關(guān)檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示制備的10%乙霉威·腐霉利微粉劑粒徑為6.18 μm，分散指數(shù)95.18%，浮游性指數(shù)86.26，含水率1.24%，坡度角67°，熱貯分解率4.12%，各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均符合標(biāo)準(zhǔn)（表4）。

圖2 助劑的篩選Fig. 2 Screening of additives

表3 10%乙霉威·腐霉利微粉劑熱貯穩(wěn)定性Table 3 Determination of the thermal storage stability of 10% diethofencarb·procymidone micropowder

表4 10%乙霉威·腐霉利微粉劑主要性能指標(biāo)Table 4 Main performance indexes of 10% diethofencarb·procymidone micropowder

2.5 10%乙霉威·腐霉利微粉劑室內(nèi)盆栽試驗(yàn)防治效果

接種2 d后清水對(duì)照開始發(fā)病，5 d后病情指數(shù)為63.87。10%乙霉威·腐霉利微粉劑在施藥劑量為100、150 g a.i./hm2時(shí)噴粉、噴霧對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果分別為89.82%和90.99%；80.27%和87.95%。10%乙霉威·腐霉利可濕性粉劑在施藥劑量為 100、150 g a.i./hm2時(shí)噴霧對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果分別為78.58%和84.83%。10%乙霉威·腐霉利微粉劑在施藥劑量為100 g a.i./hm2時(shí)噴粉防治效果顯著高于對(duì)照藥劑35%苯甲·咪鮮胺水乳劑、43%氟菌·肟菌酯懸浮劑在推薦用量時(shí)噴霧的防治效果（表5）。

表5 10%乙霉威·腐霉利微粉劑對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的盆栽防治效果Table 5 Control efficacy of 10% diethofencarb·procymidone micropowder on cucumber leaf spot disease in potted trials

2.6 10%乙霉威·腐霉利微粉劑田間藥效

田間試驗(yàn)結(jié)果表明，10%乙霉威·腐霉利微粉劑噴粉施藥對(duì)黃瓜棒孢葉斑病有很好的防治效果，用量為 100、150 g a.i./hm2時(shí)噴粉防治效果分別為84.39%、90.74%。10%乙霉威·腐霉利微粉劑、可濕性粉劑在用量為100、150 g a.i./hm2時(shí)噴霧防治效果分別為76.80%和83.11%；69.42%和82.24%。10%乙霉威·腐霉利微粉劑在用量為 100 g a.i./hm2時(shí)噴粉防治效果與 35%苯甲·咪鮮胺水乳劑在用量為300 g a.i./hm2、43%氟菌·肟菌酯懸浮劑在用量為90 g a.i./hm2時(shí)的噴霧防治效果無顯著性差異（表6）。

表6 10%乙霉威·腐霉利微粉劑對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的田間防治效果Table 6 Control efficacy of 10% diethofencarb·procymidone micropowder on cucumber leaf spot disease in fields

3 討論

黃瓜棒孢葉斑病主要依靠化學(xué)藥劑進(jìn)行防治[21]。國內(nèi)外已報(bào)道的對(duì)多主棒孢引起的病害有效的化學(xué)藥劑主要有琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑（SDHIs，啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺）、甾醇生物合成抑制劑類殺菌劑（SBIs，如咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇）、苯醌外部抑制劑（QoIs，嘧菌酯、吡唑醚菌酯和唑菌酮）、β-微管蛋白抑制劑類殺菌劑（MBCs，多菌靈、甲基硫菌靈、苯菌靈等）、二甲酰亞胺類殺菌劑（DCFs，異菌脲、腐霉利）以及氨基甲酸酯類殺菌劑（霜霉威、乙霉威等）[22]。上述藥劑用于防治黃瓜棒孢葉斑病以來，關(guān)于多主棒孢對(duì)化學(xué)藥劑的抗藥性問題不斷出現(xiàn)。因此，生產(chǎn)上迫切需要利用現(xiàn)有殺菌劑篩選具有增效作用的組合。邢光耀[23]研究表明，四氟醚唑和咪鮮胺混配對(duì)多主棒孢的毒力具有增效作用，對(duì)黃瓜棒孢葉斑病具有明顯的防治效果；鄭雪松等[24]將苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯混配藥劑在黃瓜棒孢葉斑病發(fā)病初期噴施，明顯抑制了多主棒孢的蔓延和流行。本研究選用兩種不同作用機(jī)理的化學(xué)農(nóng)藥殺菌劑乙霉威、腐霉利混配，測(cè)定了對(duì)多菌靈和乙霉威雙高抗菌株、多菌靈高抗乙霉威敏感菌株、多菌靈敏感乙霉威高抗菌株的室內(nèi)毒力，并采用菌絲生長(zhǎng)速率法和Wadley法相結(jié)合篩選最佳配比，最終獲得當(dāng)乙霉威與腐霉利最佳配比為1﹕1時(shí)，具有明顯的增效作用。推測(cè)這種增效可能與藥劑作用機(jī)理有關(guān)，腐霉利的作用機(jī)制主要是干擾滲透壓信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中組氨酸激酶和MAP激酶，這兩種酶在細(xì)胞生長(zhǎng)分裂信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵性作用，乙霉威主要抑制紡錘體的形成，兩種藥劑共同作用促進(jìn)了抑制細(xì)胞或菌絲的生長(zhǎng)分裂，從而表現(xiàn)出增效作用。ISHII[25]研究報(bào)道，在多種致病菌中苯并咪唑類殺菌劑與乙霉威具有負(fù)交互抗藥性。因此選用乙霉威作為復(fù)配的一種成分可以間接降低苯并咪唑類殺菌劑田間抗性的產(chǎn)生。

近年來，復(fù)配藥劑在農(nóng)藥中所占的比例迅速增加[26-27]。在未來的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，不僅需要更多的藥劑復(fù)配，還需要解決復(fù)配藥劑應(yīng)用中的劑型問題。將復(fù)配藥劑加工成施藥量小、利用率高的劑型是解決復(fù)配藥劑應(yīng)用的一個(gè)重要問題[15]。載體在微粉劑中占較大比例，因此載體對(duì)微粉劑的影響較大。在農(nóng)藥劑型生產(chǎn)中，通常采用單一的載體以減低實(shí)際加工的復(fù)雜化。但是在本研究中單一的載體并不能取得良好的效果，所以采用復(fù)合載體白炭黑和硅藻土，結(jié)果表明復(fù)合載體可以增加微粉劑的分散性、流動(dòng)性。劉振華等[28]研究表明，采用復(fù)合載體能夠改變可濕性粉劑的物理性能，增強(qiáng)其制劑的潤(rùn)濕性、懸浮性。選擇適合的助劑可以提高防治效果，秦寶福[11]篩選出萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物（NNO）為苦皮藤素微粉劑的最佳助劑。本研究采用單因素試驗(yàn)篩選最優(yōu)載體和助劑，方便快捷，成功率高；通過正交試驗(yàn)，確定載體助劑的最優(yōu)配比，科學(xué)可信，全面高效。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物可以提高微粉劑的分散性，既能保證微粉劑在貯存時(shí)不聚結(jié)，又能使其在施藥時(shí)均勻噴出，對(duì)病害的防治效果好；通過增加表面活性劑，可提高其抗靜電能力。試驗(yàn)中遇到的關(guān)鍵性問題為熱貯有效成分的降解問題，采用添加穩(wěn)定劑來調(diào)節(jié)，很大程度上減小了藥劑有效成分的分解率，增強(qiáng)穩(wěn)定性。

微粉劑在施藥時(shí)不需要兌水，因此不會(huì)增加棚室濕度[29-30]，操作方便，施藥過程中無高溫引起的農(nóng)藥損失，且藥劑噴出后能在棚室內(nèi)均勻彌散并附著于植株表面，持效期長(zhǎng)，減少了用藥量，提高了農(nóng)藥有效利用率，增強(qiáng)了其對(duì)病害的防治效果[31]。在盆栽試驗(yàn)中，本試驗(yàn)所研制的 10%乙霉威?腐霉利微粉劑在用藥量為100 g a.i./hm2時(shí)噴粉對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果為89.82%，顯著高于對(duì)照藥劑35%苯甲·咪鮮胺水乳劑、43%氟菌·肟菌酯懸浮劑在推薦用量時(shí)噴霧的防治效果；在田間試驗(yàn)中，10%乙霉威·腐霉利微粉劑在用量為100 g a.i./hm2時(shí)噴粉對(duì)黃瓜棒孢葉斑病的防治效果為84.39%，與35%苯甲·咪鮮胺水乳劑在用量為300 g a.i./hm2、43%氟菌·肟菌酯懸浮劑在用量為90 g a.i./hm2時(shí)的噴霧防治效果無顯著差異。病害發(fā)生之前或之初，噴粉施用 10%乙霉威·腐霉利微粉劑，在用藥量減少33.3%的情況下也能夠抑制孢子萌發(fā)及病斑的擴(kuò)展，對(duì)黃瓜新生葉片具有良好的保護(hù)作用。

4 結(jié)論

乙霉威和腐霉利混配使用對(duì)多主棒孢具有明顯的毒力增效作用，可供研制防治黃瓜棒孢葉斑病的新型混劑。按選定配方加工的10%乙霉威·腐霉利微粉劑各項(xiàng)指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)，且在用藥量小、施藥不需兌水、不增加棚室濕度的條件下對(duì)田間黃瓜棒孢葉斑病的防治效果較好，實(shí)用性強(qiáng)。

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