不同紅藍配比的光質對棉花體細胞胚胎發生和植株再生的影響

魏喜，王倩華，葛曉陽，陳艷麗，丁顏朋，趙明哲，李付廣

（1沈陽農業大學農學院，沈陽 110866；2中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽 455000）

0 引言

【研究意義】棉花是全球最重要的油料作物和經濟作物之一，其產量和纖維品質關系著國計民生[1]。世界上超過80多個國家種植棉花，中國是世界上最大的原棉生產國和消費國。但由于受到非生物脅迫、病蟲害等不利因素的制約，嚴重影響棉花的產量和纖維品質[2]。因此，通過棉花基因工程導入相關基因，增強棉花抗逆性和抗病蟲害，從而提高棉花產量和品質是必需的[3]。將轉基因技術應用到棉花育種，彌補了傳統育種方式周期長等不足[4]。然而體細胞胚胎發生是一個非常復雜的動態變化的過程，涉及到各種生物大分子的合成及運輸、信號傳導和能量變化等[5]。這種復雜性影響了體細胞胚胎發生因素的多樣性，其中光照是影響體細胞胚胎發生的重要因素之一，對其生長和分化有重要影響[6]。體細胞胚胎發生基本上都是在日光燈下培養，然而隨著科技的進步，不同發光顏色的LED燈應用到生產實踐中，探究不同光質組合對體胚發生的影響，為提高棉花體胚發生能力和加快轉基因進程奠定基礎。然而針對環境可控棉花組織培養系統，紅藍光作為人工光源對體細胞胚胎發生的研究鮮有報道。【前人研究進展】研究表明，光合色素吸收紅光和藍光的能力比其他波長的能力強，紅光影響莖的伸長、根冠比、葉綠素含量和光合作用[7-8]，然而藍光影響向光性、下胚軸伸長、葉片膨脹、氣孔開放、酶合成、葉綠體運動和基因表達等[9-10]。雖然藍光和紅光有各自不同的功能，但是單獨使用紅光或藍光不能滿足植物生長發育的要求[11]。研究表明，與單色光相比，紅藍混合光能提高光合速率和莖的質量[12-13]。紅藍光作為人工光源的研究大多集中于不同光強和光質對植物生長和品質的影響：聞婧等[14]研究表明，紅藍配比為B﹕R=1﹕8的LED光源明顯提高萵苣光合速率和品質以及降低耗電量；王君等[15]發現紅藍配比為 B﹕R=1﹕1，光強為 300 μmol·m-2·s-1處理組合提高生菜的光能、電能利用效率及干重累積量；合理光質組合和光照強度可促進烤煙幼苗根系與葉片的生長[16]。棉花體細胞胚胎發生和植株再生的過程包括愈傷誘導、胚性愈傷誘導、體細胞胚誘導和植株再生，其中，胚性愈傷分化階段是非常重要的階段，胚性愈傷分化的時間和狀態，以及環境因素都可以影響這一過程。目前，棉花體細胞胚胎發生的研究主要集中在尋求合適的棉花組織培養體系，以及挖掘調控棉花體細胞胚胎發生能力的關鍵基因。例如，董合忠等[17]研究發現2,4-D和KT同時添加對愈傷誘導的效果明顯高于單獨添加激素的效果；于婭等[18]研究發現，激素由高到低的繼代可明顯提高胚性愈傷分化率，IAA/KT比例為1﹕1—1﹕6，胚性愈傷分化率最高為50.22%。ZHENG等[3]研究認為高分化率材料生長素運輸基因PIN7和信號轉導通路基因SHY2表達量比難分化或不分化的材料表達量要高。YANG等[19]研究發現棉花體細胞胚胎發生過程中生長素合成、運輸、代謝、信號應答等相關基因表達均有不同程度的變化，進一步證實了棉花體細胞胚胎發生這一復雜性。XIAO等[20]在擬南芥中過表達棉花GhWUSs，結果發現過表達GhWUSs明顯促進擬南芥芽再生能力，并且LEC1、FUS3、ABI3和CLV3的表達量明顯上升。GE等[21]利用iTRAQ技術分離鑒定與棉花體細胞胚發育相關的關鍵通路，發現壓力響應、激素合成和信號轉導、糖和能量代謝、蛋白代謝、細胞壁代謝、細胞轉運和脂類物質轉運等通路在調控棉花體細胞胚發育方面發揮著重要的作用。【本研究切入點】目前，有關棉花體細胞胚胎發生的研究大多集中在尋找合理培養基配方和關鍵功能基因的挖掘，不同光質配比對棉花體細胞胚胎發生過程影響的研究很少，特別是不同紅藍配比的光質對棉花體細胞胚胎發生的影響更少。【擬解決的關鍵問題】本研究分別設置不同紅藍配比為 B﹕R=1﹕1、B﹕R=3﹕1、B﹕R= 1﹕3和DL的光質組合，探索其對棉花體細胞胚胎發生各個階段的影響，為提高棉花體細胞胚胎發生能力和構建大量快速的獲得棉花再生植株的工廠化生產實踐體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和生長條件

選用的棉花外植體材料是CCRI12，由中國農業科學院棉花研究所提供，試驗于2016—2018年依托中棉所轉基因課題組棉花規模化轉基因技術平臺開展。光源為光強和光質可精確調控的紅藍LED人工光源。

將難分化材料 CCRI12種子播種于中棉所試驗田，收獲時挑選成熟度良好的棉花種子，將 CCRI12種子消過毒后放在無菌苗培養基上[3]，其中，基本培養基為MS和B5，這里簡稱MSB培養基[22]，為了方便使用，首先將其配成母液 MSB培養基（大量元素MSⅠ：50 mL·L-1、微量元素 MSⅡ：5 mL·L-1、B5 維生素：5 mL·L-1和鐵鹽：5 mL·L-1），固體培養基每升再加5.5 g瓊脂粉，121℃，滅菌14 min。在MSB基礎培養基上配置一系列的培養基：無菌苗培養基（大量元素MSⅠ 50 mL、蔗糖28 g、瓊脂粉5.5 g，用超純水充分溶解后定容到1 L，pH自然）。棉花體細胞胚胎發生一般要經歷4個過程：愈傷組織誘導培養基、胚性愈傷分化培養基、體細胞胚誘導培養基和再生苗培養基，分別簡稱為CIM、ECDM、EIM和RIM，4種培養基的主要成分如表1。

適宜的培養條件是成功獲得再生棉花苗的必備條件。將配制好的培養基分裝到100 mL三角瓶中，每瓶50 mL，高溫高壓滅菌后，將無菌苗CCRI12下胚軸切成數個長度為5—7 mm的大小。所有培養物均置于（28±2）℃。

1.2 試驗設計

設置的不同紅藍配比光質分別是B﹕R=1﹕1、B﹕R=3﹕1、B﹕R=1﹕3和DL 4種組合，其中 B﹕R=1﹕1、B﹕R=3﹕1和B﹕R=1﹕3是不同的紅藍配比，DL光質處理是白光處理。紅藍光的波峰分別為 660和 460 nm。DL光質處理的光強設置在 30—50 μmol·m-2s-1。采用不同紅藍配比的LED光源，其設置依據是不同藍紅配比光源對植物的干重和鮮重[23]，以及葉片的光合速率[24]產生不同的影響。每個處理分別設置3個重復。

1.3 儀器和測量方法

采用頻譜分析儀（HR-350，臺灣，高雄）測量光譜分布，LED光源板（XM-LEDX12T8D，中國，江蘇，南京）上的紅藍光光強大小是通過調節供電電流和電燈泡的數量來確定的。

表1 棉花體細胞胚胎發生階段各培養基成分Table 1 Compositions of culture medium at somatic embryogenesis stage of cotton

CPR = (W2-W1)/W1，其中，W1為外植體培養前的初始重量；W2為外植體培養一段時間后的重量；CPR（callus proliferation rate）：指的是愈傷增殖率，即單位時間內外植體重量變化量除以外植體初始重量。

愈傷增殖量是指培養一段時間后愈傷增加的重量；胚性愈傷分化率是指由愈傷組織經過再分化成胚性愈傷組織的愈傷數量與再分化前愈傷塊總數量的比值；體細胞胚數量是指胚性愈傷組織發育成不同狀態的體細胞胚的總數，包括球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚等；生根率是指發育有根的下胚軸數量與下胚軸總數的比值。

葉綠素含量的測定：稱取樣品0.1—0.2 g（鮮重，FW），用8 mL 80%的丙酮作為提取液，4℃，黑暗條件下放置24 h，充分混勻，直到葉片褪色至白色為之。將混合物充分離心后采用分光光度計 UV-2550（Shimadzu, Kyoto, Japan）測定 646.6、663.6 和 450 nm的吸光度，根據吸光度的值計算葉綠素的濃度。葉綠素濃度的計算方法與前人研究一致[25]。

1.4 數據處理

采用Origin 8.5、SSPS20.0等軟件進行數據處理和分析。采用最小顯著差數法（the least significant difference，LSD）進行顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果

2.1 棉花體細胞胚胎發生過程

在棉花組織培養過程中，棉花下胚軸被認為是作為棉花體細胞胚胎發生的理想外植體。不同光質處理棉花體細胞胚胎發生一般要經歷4個階段（圖1-A）。分別為愈傷誘導階段誘導出愈傷（callus formation）、胚性愈傷誘導階段誘導出胚性愈傷組織（embryogenic callus，ECs）、體細胞胚階段誘導出體細胞胚（somatic embryos maturation，SEs）和再生棉花苗階段。7 d苗齡大小的CCRI12棉花下胚軸作為外植體，將下胚軸用無菌刀片切成 5—7 mm（圖1-B），混合均勻后放在愈傷誘導培養基上誘導愈傷的形成，隨著誘導天數的增加，愈傷的狀態由早期愈傷（圖 1-C）逐漸轉變為后期愈傷狀態（圖 1-D），后期愈傷狀態蓬松，含水量豐富。將愈傷轉移到胚性愈傷組織分化培養基誘導胚性愈傷（ECs）的形成。培養一段時間后，會誘導出大量的 ECs（圖 1-E）。接著將胚性愈傷轉移到體細胞胚誘導培養基，誘導體細胞胚（SEs）的形成，根據體細胞胚發育狀態的不同，將體細胞胚分為球形胚（圖 1-F）、心形胚（圖 1-G）、魚雷胚（圖1-H）和子葉胚（圖1-I）。最后將這些體細胞胚再轉移到再生植株誘導培養基上，繼續培養，直到獲得再生棉花植株（圖1-J）。

2.2 不同光質組合影響愈傷的增殖

不同的光質組合對棉花愈傷組織的增殖有不同的影響。CPR這個參數被用來衡量愈傷的增殖情況。CCRI12下胚軸在CIM上培養30 d后（圖2-A），B﹕R=1﹕1、B﹕R=3﹕1、B﹕R=1﹕3和DL 4種光組合誘導出的愈傷在顏色和質地上沒有差異，但是愈傷塊的大小有明顯的差異，B﹕R=1﹕3處理后的愈傷塊是最小的，B﹕R=1﹕1和 B﹕R=3﹕1處理后的愈傷塊比較大。根據這種愈傷狀態，分別統計4種光處理的愈傷增殖率（圖2-B），發現B﹕R=1﹕1處理的CPR最大，顯著高于B﹕R=3﹕1處理，極顯著高于B﹕R=1﹕3和DL處理。B﹕R=3﹕1處理的CPR顯著高于B﹕R=1﹕3和DL處理，B﹕R=1﹕3和DL光處理之間的 CPR不顯著。綜上說明 B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1光質組合促進愈傷的增殖，B﹕R=1﹕3處理對愈傷增殖貢獻較小；不同光質組合在愈傷后期對愈傷的顏色和質地有顯著影響。

2.3 不同光質組合對胚性愈傷階段的影響

2.3.1 不同光質組合在胚性愈傷誘導階段對未分化愈傷的影響 愈傷誘導階段主要是誘導外植體的體細胞脫分化形成大量能再分化為胚性愈傷的細胞團。圖3-A為不同光質組合在CIM上培養30 d后的愈傷轉移到ECDM上繼續培養45 d后的表型。B﹕R=1﹕1、B﹕R=3﹕1、B﹕R=1﹕3和 DL 4種光組合中，B﹕R=1﹕1、B﹕R=3﹕1和DL處理后未分化愈傷塊的體積都明顯大于B﹕R=1﹕3處理后的未分化愈傷塊的體積。為了明確不同光質組合對未分化愈傷的影響，在ECDM上培養45 d后，統計未分化愈傷的增殖量（圖 3-B）。B﹕R=1﹕1、B﹕R=3﹕1和 DL處理的光質組合的愈傷增殖量分別是 7.85、6.51和4.08 g，但是B﹕R=1﹕3處理的光質組合的愈傷增殖量只有 1.06 g。與 B﹕R=1﹕1和 B﹕R=3﹕1處理相比，B﹕R=1﹕3光質組合處理的未分化愈傷增殖量差異顯著，但是與DL處理光質組合的愈傷增殖量相比差異不顯著。因此，B﹕R=1﹕1和 B﹕R=3﹕1處理在胚性愈傷誘導階段促進未分化愈傷的大量增殖，而B﹕R=1﹕3光質組合處理對未分化愈傷增殖的貢獻較小。

圖1 棉花體細胞胚胎發生過程Fig. 1 Cotton somatic embryogenesis

2.3.2 不同光質組合對棉花胚性愈傷組織誘導的影響 在不同光質組合誘導胚性愈傷階段，除了上述增殖不分化的愈傷外，另一部分愈傷分化為胚性愈傷。圖4-A是在胚性愈傷誘導階段培養45 d時的狀態，其中B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1處理的愈傷表現出大量增殖的表型，只有部分愈傷分化為胚性愈傷（ECs），胚性愈傷分化率分別是0.25和0.16。B﹕R=1﹕3處理和DL處理的光質組合能誘導大量胚性愈傷（圖 4-A紅色橢圓），胚性愈傷分化率分別是0.70和0.56。B﹕R=1﹕3處理的光質組合的胚性愈傷分化率極顯著高于B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1處理的光質組合，顯著高于DL處理。綜上所述，與白光處理相比，B﹕R=1﹕3處理的光質組合顯著促進愈傷分化成胚性愈傷，而B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1處理的光質組合抑制胚性愈傷組織的形成。

2.4 不同光質組合對棉花體細胞胚誘導階段的影響

2.4.1 不同光質組合對棉花體細胞胚數量的影響B﹕R=1﹕1、B﹕R=3﹕1、B﹕R=1﹕3和 DL光質組合都能誘導出胚性愈傷，將黃綠色、顆粒狀的胚性愈傷組織放置在體細胞胚誘導培養基上進一步誘導，胚性愈傷的顏色逐漸變綠，首先發育成原胚然后依次發育成球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚。每個處理各選50瓶，每隔一個月繼代一次，直到體細胞胚的出現。圖5-A為不同光質組合下誘導出的體細胞胚，統計球形胚，、心形胚、魚雷胚和子葉胚總數量（圖5-B）。3次重復的試驗結果表明，B﹕R=1﹕3處理組合的體細胞胚總數顯著高于B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1處理組合誘導體細胞胚的數量。雖然B﹕R=1﹕3處理組合的體細胞胚總數與 DL處理的體細胞胚總數相比差異不顯著，但是B﹕R=1﹕3處理組合的體細胞胚總數也比DL處理的體細胞胚總數多出50個。綜上所述，B﹕R=1﹕3處理組合對體細胞胚誘導具有促進作用，B﹕R=1﹕1和 B﹕R=3﹕1處理對體細胞胚誘導有抑制作用。

圖2 不同光質處理對CPR的影響Fig. 2 Effect of different light quality treatments on CPR

圖3 不同光質處理對未分化愈傷的影響Fig. 3 Effects of different light quality treatments on undifferentiated callus

圖4 不同光質處理對棉花胚性愈傷組織誘導的影響Fig. 4 Effects of different light quality treatments on embryogenic callus induction in cotton

圖5 不同光質處理對棉花體細胞胚誘導階段的影響Fig. 5 Effects of different light quality treatments on the induction stage of cotton embryoids

2.4.2 不同光質組合對棉花體細胞胚形成下胚軸的影響 在體細胞胚誘導培養基上繼代培養1—2次后，將體細胞胚轉移到再生植株誘導培養基上培養直到長出棉花再生苗。分別在不同光質組合處理B﹕R=1﹕1、B﹕R=3﹕1、B﹕R=1﹕3和DL下繼續培養，當培養15 d后體細胞胚就誘導出下胚軸（圖6-A）。圖6-B中可以看出B﹕R=1﹕3和DL的光質組合下誘導出下胚軸的數量明顯多于B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1光質組合誘導出的下胚軸數量。B﹕R=1﹕3和DL光質組合處理之間的下胚軸數量沒有顯著差異，同樣的B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1光質組合處理之間下胚軸的數量沒有顯著差異。總之，B﹕R=1﹕1和 B﹕R=3﹕1處理不利于體細胞胚形成下胚軸，而 B﹕R=1﹕3和DL的光質組合處理促進體細胞胚形成下胚軸。

圖6 不同光質處理對棉花體細胞胚長下胚軸的影響Fig. 6 Effects of different light quality treatments on the number of hypocotyls from SEs

2.5 不同光質組合對棉花再生苗誘導階段的影響

2.5.1 不同光質組合對下胚軸生根的影響 將下胚軸在再生植株誘導培養基上繼代1次后誘導不定根的發生（圖 7-A），B﹕R=1﹕1、B﹕R=3﹕1、B﹕R=1﹕3和DL都能誘導出大量不定根。且4種不同光質組合對下胚軸長根的影響有明顯差異（圖7-B），B﹕R=1﹕1處理的下胚軸生根率明顯高于B﹕R=3﹕1、B﹕R=1﹕3和DL不同光質組合處理，且差異顯著；而B﹕R=3﹕1、B﹕R=1﹕3和DL處理之間的下胚軸生根率差異不顯著。

圖7 不同光質處理對棉花下胚軸生根的影響Fig. 7 Effects of different light quality treatments on rooting of cotton hypocotyls

2.5.2 不同光質組合對棉花再生苗和植株高度的影響 圖 8-A是不同光質組合處理下棉花再生苗的表型，在B﹕R=1﹕1和B﹕R=1﹕3不同光質組合處理的再生棉花苗植株高大，B﹕R=3﹕1和DL不同光質組合處理的棉花植株矮小。經統計成苗數量（圖8-B），B﹕R=1﹕3光質組合下成苗數量明顯高于B﹕R=3﹕1和DL處理下成苗數，且差異顯著；B﹕R=1﹕3光質組合成苗數與B﹕R=1﹕1光質組合下的成苗數差異不顯著。B﹕R=1﹕1光質組合誘導的成苗數量顯著高于B﹕R=3﹕1處理后誘導的成苗數量，但是與DL光質處理誘導的成苗數量相比差異不顯著。B﹕R=3﹕1光質組合處理與DL光質處理相比，對再生苗的誘導數量差異不顯著。統計不同光質配比下棉花植株高度（圖8-C），B﹕R=1﹕1和B﹕R=1﹕3光質組合下棉花植株的高度分別是14.58和13.93 cm，顯著高于B﹕R=3﹕1與 DL，但二者之間差異不顯著。B﹕R=3﹕1與DL光質配比下棉花植株高度分別是5.53和 5.95 cm，差異不顯著。綜上，B﹕R=1﹕1和 B﹕R=1﹕3的光質組合促進再生苗的產生和發育。

圖8 不同光質組合對棉花再生苗和植株高度的影響Fig. 8 Effects of different light qualities on cotton seedling regeneration and plant height

2.5.3 不同光質組合對棉花再生苗葉綠素濃度的影響 圖9-A是在不同光質組合處理下，棉花再生苗的葉片的表型，B﹕R=1﹕1和 B﹕R=1﹕3不同光質處理下，棉花葉片深綠，但是B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1不同光質處理下，棉花葉片嫩綠；整體上 B﹕R=1﹕3不同光質處理下棉花葉片體積大，顏色深。通過對誘導的棉花再生苗進行葉綠素含量的測定（圖9-B）。B﹕R=1﹕3的光質組合下葉綠素濃度最高，與B﹕R=1﹕1光質組合相比，差異不顯著，但是與B﹕R=3﹕1的光質組合處理相比，差異顯著；與 DL光質組合相比，差異顯著。綜上，與DL光質處理相比，B﹕R=1﹕1、B﹕R=3﹕1和B﹕R=1﹕3處理組合都有利于葉綠素的合成，但是B﹕R=1﹕3處理組合促進葉綠素的合成效果最明顯。

圖9 不同光質組合對棉花再生苗葉綠素濃度的影響Fig. 9 Effects of different light qualities on chlorophyll concentration of cotton regenerated seedlings

3 討論

體細胞胚胎的發生方式為直接發生和間接發生 2種途徑。一些報道[26]認為陸地棉體細胞胚胎發生大多是通過間接發生途徑完成，然而也有研究表明陸地棉的植株再生有可能通過體細胞胚胎直接發生，但是成功的概率非常[27-28]。下胚軸是作為體細胞胚胎發生的理想外植體，體細胞胚發生中愈傷起始的組織位置可能不完全一致，既有近表層愈傷組織內部的報道，也有內外同時起源的報道，可能與培養方式有關[29]。

3.1 不同紅藍配比的光質對愈傷組織形成和分化的影響

愈傷組織是由棉花下胚軸外植體經過脫分化形成的一類細胞團。B﹕R=1﹕1和 B﹕R=3﹕1紅藍光配比下愈傷表現出大量增殖的狀態，但愈傷分化成胚性愈傷嚴重受阻；而B﹕R=1﹕3下愈傷增殖率最低，顯著抑制愈傷的增殖，但胚性愈傷的分化率顯著提高。B﹕R=1﹕1和 B﹕R=3﹕1光質組合的愈傷大量增殖而難分化，B﹕R=1﹕3光質組合表現出愈傷增殖較小，容易分化成胚性愈傷，說明愈傷適度增殖有利于分化成胚性愈傷，這與 XU[30]的研究一致。棉花通過體細胞胚胎發生獲得再生棉花是一個非常困難的過程，周期長而且分化率非常低，基因型限制嚴重。大部分棉花品種都只能形成愈傷，不能分化成胚性愈傷，因此胚性愈傷的誘導在棉花體細胞胚胎發生過程中起著重要的作用。B﹕R=1﹕1和 B﹕R=3﹕1光質組合表現出大量增殖而難分化，B﹕R=1﹕3和DL的光質組合愈傷增殖率小而分化率比較高，說明不同光質組合對愈傷細胞多能性獲得及分化成胚性愈傷的能力的影響不同，這與 ARACELI等[31]結論一致。從體細胞脫分化成愈傷組織，再分化成胚性愈傷組織的過程，使這些細胞轉變成具有發育成體細胞胚潛力的細胞團，其間涉及到細胞生理變化、新陳代謝和基因的表達等[32]。NHUT等[33]研究表明 B﹕R=2﹕3的光質組合對油茶體細胞胚發生有利，促進油茶植物的再生；而D"ONOFRIO等[6]研究表明柑橘在紅光條件下體細胞胚胎發生能力是最高的，在紅藍混合光和正常日光燈條件下體細胞胚胎發生能力是降低的。以上結果表明，不同植物對光的響應是不同的，導致不同光質組合對體細胞胚胎發生的調控能力有很大差異。

3.2 不同紅藍配比的光質對體細胞胚發育的影響

在胚性愈傷發育成體細胞胚的過程中，各種生理和化學因素發揮著重要的作用，包括光質、激素等。B﹕R=1﹕3光質組合能明顯促進體細胞數量的增加，而B﹕R=1﹕1和B﹕R=3﹕1光質組合對誘導體細胞的產生有一定的抑制作用，導致體細胞數量的降低。B﹕R=1﹕3的光質組合可能精確調控了細胞內生長素、細胞分裂素、脫落酸和茉莉酸的變化，這些激素的變化誘導體細胞胚胎發生的Marker基因的表達，進而調控體細胞胚的發育。相似的研究指出，LEC1、LEC2、FUS3通過調控赤霉素和脫落酸的動態平衡來誘導和維持體細胞胚的發育[21]。HERINGER等[34]利用甘蔗的芽尖分生組織作為外植體研究不同紅藍光質組合對體細胞胚胎發生的影響，發現低比例的藍光抑制甘蔗植株的轉化，而藍光和紅光以及遠紅光相結合有利于葉片和根的伸長，增加葉片數和葉綠素的含量，對不同紅藍光質組合下甘蔗體細胞胚胎發生的蛋白組學分析發現，生長素、PIN的運輸蛋白和DNA甲基化伴隨著甘蔗的體細胞胚胎發生。

3.3 不同紅藍配比的光質對下胚軸的影響

B﹕R=1﹕1和 B﹕R=3﹕1光質組合下體細胞胚誘導出下胚軸的數量明顯低于B﹕R=1﹕3和DL的處理組合；B﹕R=1﹕1和 B﹕R=1﹕3處理組合下誘導出的再生棉花的高度顯著高于 B﹕R=3﹕1和 DL組合。再生棉花植株的數量很大程上取決于誘導出下胚軸的數量和質量。研究表明，藍光激活油菜素內酯（BR）和赤霉素（GA）信號通路，進而誘導HBI1表達促進下胚軸伸長[35]。不同紅藍配比的光照下CRY的差異表達調控了HBI1的差異表達，影響體細胞胚下胚軸的發育。XU[36]研究表明在紅光、藍光、白光、遠紅光條件下，BBX21的差異表達直接影響擬南芥下胚軸的長度。B﹕R=1﹕1處理后生根率明顯高于B﹕R=1﹕3、B﹕R=3﹕1和DL光質組合，可能的原因是B﹕R=1﹕1組合引起側根發育相關的基因WOX5、WOX7、WOX11和WOX12的過量表達[37]。

3.4 不同紅藍配比的光質對葉綠素濃度的影響

B﹕R=1﹕3、B﹕R=3﹕1和 B﹕R=1﹕1處理后葉綠素濃度明顯高于DL組合。研究表明LED 2種波峰和R/B對葉用萵苣葉綠素含量影響不同[38]。LEDA型（波峰為660 nm的紅光LED與450 nm的藍光LED組成）光源處理的葉綠素a、b和（a+b）含量顯著高于LEDB型光源（波峰為630 nm的紅光LED與460 nm的藍光LED組成）處理[14]。YE等[39]研究表明藍光增加金線蓮葉綠素的含量與藍光和紅光以及CK相比。不同植物對不同紅藍配比光質的響應能力不同，組織培養過程中使用的紅藍光的光強度和紅藍光質配比不一致，這些因素可能導致了不同植物在紅藍光處理下的光合作用的能力不同，最終導致葉綠素含量不同。

4 結論

在棉花體細胞胚胎發生過程中，不同發育階段對光的響應能力有差異，愈傷增殖階段對藍光的響應最敏感，但過度的愈傷增殖不利于胚性愈傷的產生；胚性愈傷、體細胞胚誘導和苗再生階段對紅光響應最敏感。采用B﹕R=1﹕3的光質組合有利于棉花體細胞胚胎的發生。

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