水稻廣譜抗稻瘟病基因PigmR功能標記的開發及應用

王芳權，陳智慧，許揚，王軍，李文奇，范方軍，陳麗琴，陶亞軍，仲維功，楊杰

（1江蘇省農業科學院糧食作物研究所/國家水稻改良中心南京分中心/江蘇省優質水稻工程技術研究中心，南京 210014；2揚州大學/江蘇省糧食作物現代產業技術協同創新中心，江蘇揚州 225009）

0 引言

【研究意義】水稻是全球重要的糧食作物之一，保證水稻高產穩產具有重要的生產和社會意義。稻瘟病是危害水稻穩產、優質和安全生產的主要因素之一，嚴重時可導致水稻減產40%—50%，甚至顆粒無收[1]。近幾年，江淮稻區稻瘟病頻發，給國家造成大量經濟損失[2]。培育與利用抗病品種是解決稻瘟病危害最經濟有效的方式[3]，而這離不開抗病基因的挖掘與利用。【前人研究進展】目前，已經定位得到了100多個水稻稻瘟病抗性相關基因，其中30多個基因被成功克隆，包括Pib[4]、Pi-ta[5]、Pi54[6]、pi21[7]、bsr-d1[8]、Piz-t[9]、Pi9[10]、Pi50[11-12]、Pigm[13-14]、Ptr[15]等。PigmR是一個廣譜抗稻瘟病基因，來源于谷梅 4號的Pigm/Pi2-Pi9基因簇[13-14]。Pigm/Pi2-Pi9基因簇在不同品種或資源材料中的R基因拷貝數不同，例如，日本晴含有7個R基因（R1、R2、R3、R9、R10、R12和R13），9311含有5個R基因（R1、R2、R3、R11和R12），谷梅4號含有 13個R基因（R1—R13）[14]。在谷梅 4號的Pigm/Pi2-Pi9基因簇中，R4、R6和R8能形成完整的轉錄產物。R6為抗病基因，是具有功能的Pigm，稱為PigmR，在日本晴、9311等大多數品種或種質中不存在等位基因；R4與PigmR在蛋白質水平上存在 4個氨基酸的差異，不具有功能，稱為Pigm-R4；R8為感病基因，稱為PigmS。研究發現，PigmR對來源于世界各地的50個稻瘟病供試菌株表現抗性[14,16]，具有抗譜廣、抗性強的特點，有很好的應用前景。傳統的水稻抗稻瘟病遺傳育種是通過對植株進行稻瘟病自然誘發或人工接種的方式進行表型鑒定，人力物力投入大，且受外界因素影響大，鑒定結果往往存在較大誤差。分子標記輔助選擇是提高抗稻瘟病水稻育種效率的有效途徑[17-18]。【本研究切入點】目前，已報道的針對抗病基因PigmR的標記大多基于Pigm/Pi2-Pi9基因簇開發，如 Indel587、Pigm-4、G1408、Pigm-SM等[19-22]，與PigmR存在一定的分離概率，在分子標記輔助選擇育種過程中，可能存在連鎖累贅或丟失目標基因的問題[20]。功能標記是基于基因內突變位點開發的，與基因完全共分離，能有效解決連鎖標記的問題。【擬解決的關鍵問題】本研究根據抗病基因PigmR的序列特點，設計并優化功能標記。利用功能標記進行分子標記輔助選擇，以獲得穗頸瘟抗性顯著改善的水稻新材料，加快該基因在抗稻瘟病水稻育種中的應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻材料包括PigmR供體材料谷梅4號在內的水稻親本材料 229份，麗江新團黑谷單基因系材料 29份，2017—2018年江蘇省遲熟中粳預備試驗材料216份和早熟晚粳區域試驗（早熟組）材料24份。遺傳群體為南粳53045/谷梅4號的BC1F2和BC1F3群體。29份麗江新團黑谷單基因系材料由國際水稻研究所提供，其他試驗材料均由江蘇省農業科學院收集和保存。水稻材料均種植于試驗田，以常規方法栽培。

1.2 PCR擴增與電泳檢測

采用 CTAB法提取水稻樣品的基因組DNA。應用Oligo 7軟件設計分子標記引物（由Invitrogen公司合成），進行 PCR擴增。PCR反應的體系為基因組DNA 2 μL、10×PCR buffer 2 μL、MgCl2（5 mmol·L-1）2 μL、dNTP（2 mmol·L-1）2 μL、上游引物（2 μmol·L-1）2 μL、下游引物（2 μmol·L-1）2 μL、Taq 酶 0.2 μL 和ddH2O 7.8 μL。擴增條件為 94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環；72℃ 10 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠成像儀拍照，并記錄結果。

1.3 序列分析

谷梅4號Pigm/Pi2-Pi9基因簇參考序列的GenBank登錄號為KU904633[14]。采用Snapgene 2.3.2軟件進行核酸序列分析。

1.4 表型鑒定

在江蘇省農業科學院試驗田進行稻瘟病表型鑒定。稻瘟病的供試菌株為江蘇省農業科學院植物保護研究所分離得到的江蘇省稻瘟病代表菌株（2018-4、2018-65、2018-102、2018-222和2018-241）的混合菌。將供試菌株移植RCA（玉米粉40 g、稻稈50 g和瓊脂20 g）培養基上，25℃培養7 d，用黑光燈照射72 h，待稻瘟病菌產生孢子后，再用無菌水洗下，配成10×10倍顯微鏡下每視野30—40個孢子的懸浮液。采用人工注射接種法進行水稻穗頸瘟的抗性鑒定，于水稻抽穗前3—4 d注射混合菌株，每穗注射1 mL菌液，做好標記。在水稻灌漿成熟后進行抗性調查，參照國際水稻研究所分級標準調查穗頸瘟抗性級別[23]。

2 結果

2.1 PigmR序列分析及功能標記的設計

Pigm基因簇中，PigmR與Pigm-R4、PigmS高度同源且緊密連鎖，PigmR為有功能的Pigm，Pigm-R4不具有功能，PigmS為感病基因。通過序列比對發現，PigmR與PigmS的編碼區存在82個堿基差異，PigmR與Pigm-R4的編碼區存在6個堿基差異，其中第2 557、2 572、2 579、2 881位為PigmR與PigmS、Pigm-R4均存在差異的堿基（圖1）。

為了開發PigmR特異的功能標記，根據PigmR與PigmS、Pigm-R4均存在的差異位點，設計了8對基因特異檢測引物（表1），其中GMR-1、GMR-2、GMR-3和 GMR-4用于特異檢測PigmR，GMS-1、GMS-2、GMS-3和GMS-4用于特異檢測PigmS。部分引物中引入了堿基錯配，GMR-2F、GMS-2F、GMR-4F和GMS-4F 引物 5′-3′的倒 3位堿基由 A 錯配為 C，GMR-4R和GMS-4R引物5′-3′的倒3位堿基由G錯配為C。PigmR在很多品種中不存在，因此，還設計了2對特異檢測內參基因Actin1的分子標記（表1），以排除樣品、試驗操作等過程中引起的假陰性。

圖1 PigmR與部分同源基因在變異位點的序列比對Fig. 1 Sequence alignment of the variation sites between PigmR and parts of its homologous genes

表1 分子標記引物Table 1 The primers of molecular marker

2.2 功能標記的檢測及優化

以谷梅4號、日本晴和黃華占的基因組為模板，對設計的分子標記進行PCR篩選（圖2）。結果發現，GMR-1、GMR-2和GMR-4 3個標記對谷梅4號、日本晴和黃華占3個品種均無條帶；GMS-1、GMS-2和GMS-3 3個標記能在谷梅 4號和日本晴中擴增出條帶；GMR-3和GMS-4僅能在谷梅4號中擴增出條帶。根據設計，GMR-3特異檢測的是抗病基因PigmR，GMS-4特異檢測的是感病基因PigmS，因此，選取GMR-3進行條件優化。

為進一步分析 GMR-3對PigmR的特異性，將PigmR與Pi9、Pi2和Piz-t進行比較，發現GMR-3上下游引物能特異匹配PigmR（圖1）。

PigmR在很多品種或材料中不存在，因此還設計了特異檢測內參基因Actin1的分子標記（表1），以排除樣品、試驗操作等過程中引起的假陰性。檢測結果發現，Actin1-1和Actin1-2均能對谷梅4號、日本晴和黃華占擴增出特異明亮條帶（圖 3）。為優化引物的濃度配比，選取GMR-3和Actin1-1引物，設計12個不同濃度試驗（圖4）。結果發現，0.4 μmol·L-1GMR-3與 0.1 μmol·L-1Actin1-1組合濃度擴增出PigmR和Actin1特征條帶的效率相當，效果最優（圖4）。將 0.4 μmol·L-1GMR-3 和 0.1 μmol·L-1Actin1-1引物混合組成的分子標記命名為GMRA。攜帶PigmR的樣品能被GMRA同時擴增出146和98 bp條帶，不攜帶PigmR的樣品僅能被GMRA擴增出146 bp條帶。

2.3 GMRA標記檢測水稻材料

利用GMRA標記檢測229份水稻親本材料，結果表明，只有谷梅4號能檢測到PigmR條帶，其他粳稻和秈稻品種均不能擴增出98 bp特征條帶（圖5和表2）。為進一步驗證GMRA的特異性，還檢測了29份麗江新團黑谷單基因系，發現這些材料均無PigmR特征條帶，表明GMRA有很好的特異性，且能區分PigmR與Pi9、Piz、Piz-t等同源性高的基因（電子附圖1和表3）。

圖2 PigmR分子標記的擴增結果Fig. 2 The PCR amplification products of molecular maker for PigmR

圖3 Actin1鑒定分子標記的擴增結果Fig. 3 PCR amplification products of molecular maker for Actin1

以上結果表明，針對抗病基因的特異序列設計的GMRA標記能特異檢測谷梅4號攜帶的PigmR，可用于分子標記輔助選擇育種。

為進一步明確PigmR在江蘇粳稻育種中的利用情況，用GMRA標記檢測了江蘇省遲熟中粳預備試驗中間材料216份、早熟晚粳區域試驗（早熟組）中間材料24份，共鑒定到3份中間材料攜帶PigmR，表明PigmR在江蘇粳稻育種中已經使用，但使用頻率仍然很低。這些中間材料可以作為良好的供體材料，在粳稻育種中進一步利用。

2.4 GMRA標記在育種中的應用

利用GMRA標記對南粳53045/谷梅4號的BC1F2群體的320個單株進行檢測，共檢測到198個單株攜帶PigmR，部分單株檢測結果見圖6。保留攜帶PigmR的單株，待成熟后按單株收種。種植BC1F3代株系，在部分株系中各選取10個單株進行檢測。若10個單株均表現為攜帶PigmR，根據分離比例，該株系為PigmR純合系；若 10個單株中有部分單株不攜帶PigmR，表明該株系的PigmR分離。本研究共檢測了19個株系的190個單株，6個系的PigmR純合，13個系的PigmR分離（圖7）。隨機選取38個單株進行穗頸瘟接種發現，攜帶PigmR的單株均對穗頸瘟表現為抗或中抗；不攜帶PigmR的單株均表現為高感（圖8和電子附表1）。以上結果表明，GMRA功能標記可以準確鑒定PigmR，具有很好的特異性，能有效用于分子標記輔助選育抗稻瘟病水稻新品種。

圖4 PigmR鑒定引物的優化Fig. 4 Optimization of identification primers for PigmR

圖5 GMRA標記檢測水稻品種/品系Fig. 5 Molecular detection for partial varieties by GMRA

圖6 GMRA標記檢測南粳53045/谷梅4號的BC1F2群體單株Fig. 6 The molecular detection of BC1F2 of Nangeng53045/Gumei 4 by GMRA

表2 GMRA標記鑒定部分水稻材料Table 2 Identification of partial rice materials by GMRA

續表2 Continued table 2

續表2 Continued table 2

表3 GMRA標記鑒定部分麗江新團黑谷單基因系Table 3 Identification of partial monogenic lines of Lijiangxintuanheigu by GMRA

圖7 GMRA標記檢測南粳53045/谷梅4號的BC1F3群體部分單株Fig. 7 The molecular detection of BC1F3 of Nangeng53045/Gumei 4 by GMRA

圖8 南粳53045/谷梅4號的BC1F3群體穗頸瘟鑒定結果Fig. 8 Infection of rice panicle blast in BC1F3 plants of Nangeng53045/Gumei 4

3 討論

稻瘟病是世界上最嚴重的水稻病害之一，被稱為水稻的“癌癥”。稻瘟病菌的生理小種組成復雜，群體大，具有高度的多樣性和較強的變異性[24-25]。目前，推廣品種僅攜帶一些抗譜較窄的抗病基因，容易因病菌種群結構的演化及新小種的產生而喪失抗性[26]。例如，近幾年，在長江中下游地區廣泛利用且具有較好抗性的Pi-ta等基因已經有抗性減弱的趨勢。因此，利用具有廣譜持久抗性的基因對于水稻抗稻瘟病育種具有重要的生產實踐意義。

Pigm是一個廣譜持久抗稻瘟病基因（簇），對來源于全國不同地區稻瘟病的代表性小種抗性頻率高達91.9%，在生產上具有廣泛的應用前景[16,26-28]。然而，Pigm基因簇與品質相關基因Wx和ALK、生育期相關基因Hd1和Hd3等農藝性狀相關基因連鎖[29-31]。而且，在谷梅4號的Pigm基因簇中，含有13個R基因，同時含有抗病基因PigmR和感病基因PigmS，以及與PigmR高度同源但無功能的Pigm-R4[12]。Pigm-R4、PigmS和PigmR緊密連鎖，使得PigmR的利用顯得困難重重。利用PigmR改良水稻稻瘟病抗性的同時保留優異農藝性狀，需要經過多代的回交篩選，而在此過程中選用的分子標記非常關鍵。

目前，已經報道的針對抗病基因PigmR的標記大多基于其基因簇開發，如Indel587、Pigm-4、G1408、Pigm-SM等[14,19-22]，與PigmR存在一定的分離概率，在分子標記輔助選擇育種過程中可能存在連鎖累贅或丟失目標基因的問題[20]。利用Pigm基因簇內Pigm-R4、PigmS和PigmR的堿基差異，設計的分子標記GMR-3為功能標記，該標記能區分PigmR與Pi9、Piz、Piz-t等同源性較高的基因。GMR-3為顯性標記，即能擴增出條帶的樣品攜帶PigmR，不能擴增出條帶的樣品不攜帶PigmR。在基因的分子檢測過程中，往往會因為 DNA樣品質量、試驗試劑的差異、試驗操作人員的失誤等原因而導致PCR的擴增失敗，而顯性標記不能像等位基因特異PCR、CAPS標記一樣區分等位基因而避免這種假陰性[32]。因此，通過設計內參基因的檢測標記，與顯性標記同時對樣品進行檢測，有利于避免這種假陰性。由于GMR-3和Actin1-1擴增產物差異較大，引物GMR-3F、GMR-3R、Actin1-1F和Actin1-1R可以在一個PCR中進行，攜帶PigmR的樣品能被GMRA同時擴增出146和98 bp條帶，不攜帶PigmR的樣品僅能被GMRA擴增出146 bp條帶。該方法可以簡單可靠的對樣品進行鑒定。通過對 229份育種材料檢測發現，GMRA可以特異擴增來源于谷梅4號的PigmR，特異性顯著。以優質粳稻品系南粳53045為背景，利用GMRA進行分子標記輔助選擇，成功獲得了穗頸瘟抗性顯著提高的新株系，表明GMRA能用于分子標記輔助選擇育種中。因此，本研究設計的功能標記GMRA可以有效改善對PigmR的鑒定效果及在育種的應用。

4 結論

根據PigmR與Pigm-R4、PigmS的堿基差異設計和優化的功能標記GMRA能有效區分PigmR與Pi9、Piz、Piz-t等同源性較高的基因，具有很強的特異性，且可以有效避免因 PCR擴增失敗引起的假陰性。PigmR在江蘇粳稻育種中已經使用，但使用頻率仍然很低，篩選獲得的材料可以作為PigmR資源應用于粳稻抗稻瘟病育種中。

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