內皮素受體A基因多態性與中青年原發性高血壓的相關性研究

閆生玲 屈麗娜 薛恩忠

原發性高血壓（essential hypertension，EH）是臨床最常見的慢性病之一，長期高血壓是心腦血管疾病的重要危險因素。近年來，有流行病學研究結果顯示EH發病不斷呈現年輕化趨勢，越來越多中青年人罹患該疾病[1]。有學者認為生活方式的改變可能是其主要原因；也有研究提出基因遺傳因素對中青年人發生EH所起到的作用值得進一步深入關注[2-4]。內皮素作為迄今所發現的作用最強的縮血管因子，可通過與內皮素受體（endothelin receptor type A，EDNRA）結合發揮縮血管作用，既往已有多項研究結果證實內皮素生成增多或EDNRA活性異常均與高血壓的發生發展相關[5-7]。隨著分子生物學發展，有研究發現EDNRA基因多態性具有多種生物學功能，可能與動脈瘤、青光眼等疾病發生相關[8-10]。然而目前EDNRA基因多態性與EH相關性的研究相對較少，本研究以中國北方漢族中青年人作為觀察人群，比較EH患者與健康體檢者EDNRA基因多態性的差異，為臨床工作提供參考。

資料與方法

1.研究對象 選擇2015年1月至2018年1月，于我院心血管內科治療的高血壓患者納入EH組。納入標準：①年齡＞18歲，≤45歲；②出生并長期生活于陜西地區的漢族人；③高血壓診斷符合2010中國高血壓防治指南[11]；④入組患者彼此無血緣關系。排除標準：①各種原因導致的繼發性高血壓；②合并糖尿病、甲狀腺疾病、心力衰竭、心房顫動、心肌梗死或卒中、嚴重心律失常、嚴重肝腎功能障礙及惡性腫瘤病史；③妊娠期女性。本研究共納入338例EH患者，其中男性204例，女性134例，平均年齡（39.2±4.7）歲。根據所納入EH患者年齡、性別納入同時期于我院行健康體檢的志愿者300例作為對照組，其中男性175例，女性125例，平均年齡（39.1±4.3）歲。本研究通過本院倫理委員會審核批準，所有入組患者充分知情同意。

2.一般臨床資料采集 收集所有入組人員以下基本資料：①一般人口學資料，包括姓名、性別、年齡等；②一般生物學資料，包括體質量、身高、血壓等，計算BMI；③生活行為方式，吸煙、飲酒等，本研究吸煙定義為平均每日至少吸煙1支，且至少連續1年；飲酒定義為平均每日飲白酒≥50 g，或紅酒≥150 g，或啤酒≥500 g，且至少持續1年。通過采集清晨空腹靜脈血，檢測患者血脂水平。所有調查員均經統一培訓，并采用統一編制的問卷進行調查。

3.基因多態性檢測 采集清晨空腹時外周靜脈血3mL，采用氯仿飽和酚法提取全基因組DNA，采用聚合酶鏈反應聯合DNA直接測序法檢測EDNRA基因rs1801708和rs5335位點多態性。應用Primer5.0及Oligo6.0軟件進行引物設計及驗證，本研究所用引物由上海生共生物有限公司合成，rs1801708位點上游引物：5′-AAGAGGATGGGTTCCTCTGC-3′，下游引物：5′-CCCAGTCCCCGATAAGAAAG-3′；rs5335位點上游引物：5′-AACACAGACCGGAGCAGCCATA-3′，下游引物：5′-GGGTGTGGGAGTGAATTAAGGAAGAA-3′。嚴格按照常規PCR擴增操作流程進行操作，兩位點退火溫度分別設置為56℃和58.5℃。PCR產物采用美國ABI公司配套專用BigDye?Terminator v3.1 Kit試劑盒進行線性擴增，最后采用ABI 3730測序儀進行測序。

4.統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件分析處理，本研究計量資料均服從正態分布，結果以均數±標準差表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料結果以構成百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗。采用二分類多因素Logistic后退逐步回歸法評價EDNRA基因多態性與ACS的相關關系。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.兩組患者基本臨床資料 兩組在BMI、收縮壓和舒張壓3項指標，差異具有統計學意義（均P＜0.05）；在性別、年齡、吸煙、飲酒、TG、TC、LDL-C及HDL-C等方面差異無統計學意義（均P＞0.05），如表1。

2.基因分型及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗結果 人群中EDNRA基因rs1801708和rs5335位點均存在三種基因型，本研究兩組研究對象此兩位點的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（均P＞0.05），具有較好的群體代表性。

3.EDNRA基因多態性與EH的關系 如表2，EH組與對照組比較，兩組rs1801708位點基因型和等位基因分布頻率，差異均無統計學意義（均P＞0.05）；兩組rs5335位點基因型分布頻率，差異無統計學意義（P＞0.05），等位基因頻率分布，差異存在統計學意義（P＜0.05）。

表1 兩組患者基本臨床資料[±s，n（%）]

表1 兩組患者基本臨床資料[±s，n（%）]

注：1 mmHg=0.133 kPa

項目 對照組（n=300）EH組（n=338） t/χ2值 P值男性/女性 175/125 204/134 0.269 0.604年齡/歲 39.1±4.3 39.2±4.7 0.306 0.763 BMI≥25 kg/m2 104（34.7） 190（56.2） 29.696 0.000吸煙 117（39.0） 137（40.5） 0.156 0.693飲酒 16（5.3） 26（7.7） 1.438 0.230高血壓病史/年 3.4±2.3 - - -收縮壓/mmHg 124.2±17.4 150.7±22.1 16.673 0.000舒張壓/mmHg 80.5±10.4 89.2±11.6 9.921 0.000 TG/（mmol/L） 1.4±0.6 1.5±0.7 0.849 0.408 TC/（mmol/L） 3.9±1.0 4.1±1.2 0.855 0.467 LDL-C/（mmol/L） 2.5±0.8 2.7±1.0 0.998 0.397 HDL-C/（mmol/L） 1.2±0.2 1.1±0.3 1.416 0.239

4.分層分析 進一步按照BMI將研究對象分為BMI＜25 kg/m2和BMI≥25 kg/m2兩層進行分析，結果顯示：對于rs1801708位點，在BMI＜25 kg/m2和BMI≥25 kg/m2兩層中，EH組和對照組基因型和等位基因分布頻率，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。對于rs5335位點，在BMI＜25 kg/m2時，EH組基因型/等位基因分布頻率，在共顯性基因模型、隱性基因模型和等位基因模型下與對照組比較，差異均具有統計學意義（均P＜0.05）；在BMI≥25 kg/m2時，EH組與對照組比較在各種基因模型下，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表3。

表2 EDNRA基因多態性與EH的關系[n（%）]

5.多因素分析 校正性別、年齡等混雜因素后，多因素分析結果顯示EDNRA基因rs5335位點C等位基因是陜西地區漢族中青年BMI＜25 kg/m2人群發生EH的保護性因素（OR=0.484，95%CI：0.361～0.836，P=0.007）。

表3 不同BMI分層分析結果[n（%）]

討 論

近年來，不斷有研究結果顯示基因遺傳因素可能與EH發生相關[2，4]。然而，不同研究在研究對象納入標準、排除標準多方面存在差異，所得的研究結果多數不能被復制，甚至有部分研究結果相互之間彼此矛盾。作者認為EH作為一種基因遺傳因素、環境因素和行為因素共同作用疾病，隨著患者年齡的增長，環境因素和行為因素在EH發病中所起到的作用愈多，基因遺傳因素的作用也逐漸被掩蓋，因此研究中青年EH患者基因遺傳因素與發病的相關性，對全面認識EH具有重大意義。

越來越多研究證據表明內皮素與EH易感性相關，EH患者血清內皮素-1水平顯著升高[12]。內皮素參與EH發生的具體機制目前尚不明確，可能在于：首先，內皮素的直接縮血管作用調控血壓變化；其次，有研究發現內皮素與血管內皮細胞炎性反應相關，參與動脈粥樣硬化發生發展的病理改變過程，進而導致高血壓發生[13]；另外，還有研究結果提示內皮素可通過直接介導機體鈉尿排除以參與血壓變化[14]。近年來，還不斷有研究結果顯示內皮素相關基因多態性可能與EH易感性相關，已證實內皮素-1基因存在Lys198Asn、TaqⅠ酶切位點等多個SNP位點與EH發生相關[15]。

內皮素受體包括A、B、C三種亞型，在哺乳動物中表達的主要是A型和B型，兩者均在心血管組織中廣泛表達，但其生理功能存在顯著差異，EDNRA主要與內皮素-1相互作用，介導縮血管作用，EDNRB介導舒張血管作用。人類EDNRA基因位于第4號染色體上，目前研究發現rs1801708、rs5335、rs5343、rs6841581等多個多態性位點均可能具有生物學意義，其中rs1801708和rs5335位點多態性被認為與多種心腦血管疾病關系密切[10，16]。如Lajemi等[17]以未治療的高血壓患者為研究對象，發現EDNRA基因的rsl801708位點G等位基因可增加脈搏波速率，提示EDNRA基因多態性影響動脈硬化的參數；Rahman等[18]發現rs5335位點每攜帶1個G等位基因可使收縮壓升高2.5 mmHg，舒張壓升高1.5 mmHg。基于上訴研究結果，作者認為有理由推測EDNRA基因多態性與EH易感性相關。

本研究以陜西地區漢族中青年人群為研究對象，結果顯示EH組和對照組比較，rs5335位點等位基因分布頻率，差異具有統計學意義，EH組患者C等位基因頻率明顯低于對照組；兩組rs1801708位點基因型、等位基因分布頻率，差異均無統計學意義。考慮兩組BMI存在差異，且一般認為BMI與血壓水平密切相關，本研究進一步按照BMI大小進行分層分析，結果顯示在BMI＜25 kg/m2時，EH組，rs5335位點基因型/等位基因分布頻率在共顯性基因模型、隱性基因模型和等位基因模型下與對照組比較差異均具有統計學意義；而在BMI≥25 kg/m2時，EH組與對照組比較在各種基因模型下其差異均無統計學意義。同時，研究結果顯示不同分層中，各種基因模型下均未發現EH組和對照組rs1801708位點基因型/等位基因分布頻率存在顯著差異。最后，本研究采用Logistics多因素回歸分析法，校正性別、年齡等混雜因素，結果顯示rs5335等位基因C是BMI＜25 kg/m2的中青年人群發生EH的保護性因素。

綜上所訴，本研究發現EDNRA基因rs5335位點多態性與中青年EH發病相關，尤其對于BMI＜25 kg/m2人群。最后，須指出本研究也存在不足之處，首先，本研究僅為單中心研究結果，納入樣本量相對較少，檢驗效能低，期待后續多中心大樣本研究結果加以驗證；其次，EH發病系多因素共同作用所致，EDNRA基因除此之外也還包括等多個多態性位點，對于其他因素，其他位點基因多態性以及彼此之間交互作用與EH易感性的關系，也期待后續進一步研究。