結腸癌組織血管生成抑制素結合蛋白、遷移誘導蛋白-7、MMP-2表達及其與血管生成擬態的相關性

李明玉，賈喜花

(保定市第一中心醫院，河北保定071000)

結腸癌是近年發病率逐漸升高的消化道惡性腫瘤。目前結腸癌已成為我國重點防治的腫瘤之一。因此深入研究結腸癌發生發展的分子機制對改善患者總生存期具有重要意義。有研究[1]顯示,腫瘤轉移是影響結腸癌患者治療效果和不良預后的關鍵因素之一。而新生血管形成是腫瘤生長及轉移過程中不可或缺的因素[2]。內皮性血管及血管生成擬態(vasculogenic mimicry，VM)是腫瘤血供的兩種重要形式。血管生成抑制素結合蛋白(AMOT)可調控內皮細胞的遷移和管狀結構形成，在內皮性血管生成中起重要作用。VM是一種以腫瘤細胞為內襯的管狀結構，具有血液灌注功能，區別于內皮細胞依賴性血管，在乏氧的腫瘤組織中是血液供應的主要方式[3]。遷移誘導蛋白-7(MIG-7)是VM形成過程中的重要調節因子，可增加腫瘤細胞的可塑性變化[4]。而基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)在內皮性血管[5]及VM形成[6]中均有參與。目前關于結腸癌組織AMOT、MIG-7、MMP-2的表達變化相關報道較少。2018年3～9月，我們觀察了結腸癌組織AMOT、MIG-7及MMP-2的表達變化，并分析其與VM的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇保定市第一中心醫院2015年1月～12月間收治的結腸癌患者，其中男37例，女33例；中位年齡58歲(28～88歲)，其中<50歲者17例，≥50歲者53例；分化程度為高分化35例，中分化21例，低分化14例；腫瘤直徑<5 cm者 26例，≥5 cm者44例；浸潤深度T1、T2者34例，T3、T4者36例；有淋巴結轉移者22例，無淋巴結轉移者48例。入選患者臨床病理資料完整，病理明確診斷為腺癌。所有患者未合并其他惡性腫瘤，術前未進行抗腫瘤治療(全身化療及靶向治療)。70例患者均行結腸癌根治術，術中保留結腸癌組織及癌旁正常組織。本研究經本院倫理委員會批準同意,納入者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 試劑 AMOT鼠抗人多克隆抗體(產品編號60156-1-Ig)購自武漢三鷹生物科技公司、兔抗人多克隆抗體MIG-7(產品編號AY-66655R)購自上海安研生物科技公司；兔抗人多克隆MMP-2(產品編號bs-4599R)、兔抗人多克隆抗體CD34(產品編號bs-0646R)、鼠/兔通用型二抗(產品編號sp-0022)、DAB試劑盒及PAS染色試劑盒均購自北京博奧森生物科技公司。

1.3 癌組織及癌旁組織AMOT、MIG-7及MMP-2檢測 采用免疫組化法。按照En Vision二步法的步驟進行實驗：將石蠟標本以4 μm厚連續切片，烤干，于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水洗，高壓熱修復抗原，3%H2O2去除內源性過氧化物酶，加一抗 AMOT(1∶100)、MIG-7(1∶100),、MMP-2(1∶100),抗體4 ℃過夜，PBS水洗后加二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，脫水透明，中性樹膠封固。用PBS代替一抗作為陰性對照。鏡下AMOT陽性物質定位于胞核及胞質，MIG-7及MMP-2定位于胞膜及胞質，染色出現棕黃色為陽性表達。選擇5個高倍視野(400×)進行觀察，計數陽性細胞數及著色深度，無陽性細胞或陽性細胞數<10%計0分，陽性細胞10%～40%計1分，陽性細胞41%～70%計2分，陽性細胞>70%計3分；細胞不著色計0分,淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計算3分。用染色強度得分和細胞數得分乘積作為判斷標準，≤1判為陰性，>1判為陽性。最終免疫組化結果由兩位經驗豐富的病理科醫師采用獨立雙盲法判定。

1.4 癌組織VM測算 采用CD34與PAS雙重染色法。取癌組織石蠟標本，進行CD34免疫組化染色，DAB染色后蒸餾水沖洗使反應終止。按照說明書步驟行PAS染色。CD34定位于胞膜及胞質，染色后胞質出現棕黃色為陽性表達；選擇5個高倍視野(400×)進行觀察，計數CD34陽性細胞數占所觀察細胞總數百分比及著色強度綜合計算，陽性細胞數占所觀察細胞總數百分比：無陽性細胞或陽性細胞<10%計0分，陽性細胞10%～40%計1分，陽性細胞41%～70%計2分，陽性細胞>70%計3分；著色強度：細胞不著色計0分,淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計算3分。二者相乘結果≤1判定為CD34陰性，>1判定為CD34陽性。PAS染色后鏡下觀察基質呈紅色可判為PAS陽性。顯微鏡下觀察CD34與PAS雙重染色結果，為CD34陰性、PAS陽性判定為VM陽性，計算VM陽性率(VM陽性例數/總例數×100%)。

1.5 隨訪方法 通過復查、電話聯系等方式進行隨訪，隨訪時間(月)自手術之日起至2018年11月30日，隨訪終點為死亡、失訪或生存至截止日期，隨訪期間的失訪者算作刪失值。

1.6 統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件進行處理。計數資料比較用χ2檢驗；相關性分析應用Spearman相關性分析法，生存分析采用 Kapla-Meier 法，并應用Cox比例風險模型分析獨立預后因素。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

癌組織 AMOT、 MIG-7、MMP-2陽性率分別為58.6%(41/70)、61.4%(43/70)、70%(49/70)，癌旁組織分別為31.4%(22/70)、0、4.3%(3/70)，與癌旁組織比較，癌組織 AMOT、 MIG-7、MMP-2陽性率均較高(P均<0.05)。結腸癌組織VM陽性率為32.9%(23/70)。AMOT、MIG-7、MMP-2表達及VM量與結腸癌患者臨床病理參數的關系見表1。

AMOT表達與結腸癌患者分化程度及淋巴結轉移有關(P均<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤深度無關(P均>0.05)；MIG-7、MMP-2的表達水平及VM陽性量與分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移有關(P均<0.05)。

表1 AMOT、MIG-7、MMP-2表達及VM陽性量與結腸癌患者臨床病理參數的關系(例)

結腸癌組織AMOT表達與VM陽性量無相關性(P>0.05)，而MIG-7、MMP-2表達與VM陽性量均呈正相關(r分別為0.304，0.259；P均<0.05)。

Kaplan Meier 分析結果顯示，分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、MIG-7表達水平與結腸癌患者的預后有關，而Cox回歸模型分析顯示年齡、分化程度、淋巴結轉移、MIG-7蛋白水平及VM陽性是結腸癌預后的獨立危險因素，見表2。

表2 結腸癌患者預后的多因素生存分析結果

3 討論

AMOT于2001 年首次被發現，Troyanovsky等[7]通過以血管生成抑制素為誘餌的酵母雙雜交系統在人類胎盤cDNA文庫中篩選得到。Aase等[9]研究發現,敲除了斑馬魚AMOT基因后，于斑馬魚胚胎組織中早期觀察到血管內皮生成障礙的現象，而在補充了AMOT后，血管內皮生成障礙現象得到逆轉；并且在AMOT敲除后，內皮細胞對VEGF誘導的遷移無應答，證明了AMOT在生理性血管形成及VEGF誘導的內皮細胞遷移過程中的重要位置。此外，在關于AMOT與結腸癌的研究[10]中發現，AMOT可以通過Hippo-YAP通路上調ERK和AKT的磷酸化水平，而p-ERK和p-AKT涉及多種與腫瘤增殖、侵襲和轉移相關的信通路。

AMOT在部分腫瘤組織中高表達,可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。Byun等[11]研究發現，鼻腔和副鼻竇的內翻性乳頭狀瘤組織AMOT高表達。Hsu等[12]發現，AMOT 在肺癌組織和高侵襲性肺癌細胞中呈低表達。以上研究均提示AMOT在不同類型的癌細胞中的作用不同。本研究顯示AMOT在結腸癌中高表達。AMOT還與結腸癌分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移有關，提示AMOT的陽性表達與結腸癌的惡性程度和疾病進展密切相關。未發現AMOT與VM之間存在相關性。以上結果均表明該蛋白與VM的形成并無顯著關聯。此外,Kaplan Meier生存分析及Cox回歸模型均顯示AMOT與結腸癌預后無關，但本研究存在樣本例數少、實驗條件有限等不足，尚需后續研究進一步證實。

近年來國內外學者[13]先后在細胞、動物、人體層面證實了結腸癌組織中VM的存在。VM對腫瘤的影響主要集中在以下兩個方面：①促進腫瘤的生長。傳統抗血管生成藥物對VM不起抑制作用，反而可能因為腫瘤組織的缺氧促進了VM的形成。在內皮性血管生成受抑的情況下，VM可繼續為腫瘤組織提供營養，致使腫瘤組織進一步生長[14]；②增加遠處轉移機率。相比于內皮依賴性血管，腫瘤細胞自身構成VM的管腔壁，可以直接脫落進入血液循環，發生轉移[15]。可見VM形成會促進癌細胞生長,增加腫瘤血道轉移的幾率。

MIG-7及MMP-2是VM形成的重要調節因子。本研究結果顯示，MIG-7及MMP-2的表達與VM存在正相關。MIG-7能引起ERK1/2磷酸化水平升高，p-ERK1/2可作用于PI3K，進而增加其下游的MMP-2裂解層黏連蛋白5(LN-5v2)的能力。LN-5v2的裂解片段沉積于細胞外基質，參與基質重塑，促進VM 結構形成[15]。同時MIG-7可增加腫瘤細胞的可塑性，使其可以模擬內皮功能，參與構成VM的管腔壁[16]。MMP-2是基質金屬蛋白酶家族(MMPs)的重要成員之一，參與VM形成的主干信號通路—EphA2/PI3K/AKT/MMPs[6]。進一步猜測其具體機制可能為MMP-2裂解LN-5v2，促進細胞外基質重塑。

MIG-7及MMP-2在多種惡性腫瘤[17，18]中均存在過表達現象，且過表達的MMP-2與腫瘤的浸潤轉移相關。本研究顯示，結腸癌中MIG-7及MMP-2的陽性率高于癌旁組織，表明二者可能與結腸癌的發生、發展相關。在與結腸癌臨床病理特征的研究中發現，MIG-7、MMP-2及VM的陽性率與分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移有關，表明三者的陽性率與結腸癌的惡性程度相關，同時還與結腸癌的轉移過程關系密切。Kaplan Meier生存分析顯示，分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、MIG-7蛋白水平與結腸癌患者預后相關，而Cox回歸模型分析顯示年齡、分化程度、淋巴結轉移、MIG-7蛋白水平及VM陽性是結腸癌預后的獨立危險因素。由此可見MIG-7對于判斷結腸癌患者的預后具有重要參考價值，可作為評估結腸癌患者預后的潛在分子標志物。

綜上所述，結腸癌組織中AMOT、MIG-7、MMP-2均呈高表達。MIG-7、MMP-2可能通過調控結腸癌VM的形成，影響結腸癌的侵襲、轉移及預后。MIG-7、MMP-2可作為評估腸癌患者預后的潛在分子標志物。