宮頸鱗癌組織中P21活化的激酶1和Sprouty相關EVH1域蛋白1表達觀察

王曉，申倩倩，王焱，張俊俊

(1河南科技大學臨床醫學院，河南洛陽 471003；2河南科技大學第一附屬醫院)

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤[1,2]。現已證實高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發病的高危因素，目前已知HPV病毒有120多個型別，其中與宮頸癌發展相關的高危型HPV有18種，HPV感染主要影響轉錄的調控、基因組的復制及宿主細胞的轉化，且HPV感染可影響多種信號通路的傳導[3]。P21活化的激酶(PAK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)上游調控因子，參與細胞增殖和分化、細胞轉化、細胞凋亡、細胞骨架系統重排、細胞周期和細胞遷移[4]。已有學者[5]研究證實PAK在肺癌、胃癌、食管癌等多腫瘤組織中呈高表達。Sprouty相關EVH1域蛋白(Spred)可抑制細胞分化，對多種生長因子誘導的Ras-ERK途徑均有抑制作用；Ras-MAPK途徑在細胞的生長、分裂、增殖和分化過程中起重要作用，并且該途徑與多種腫瘤的發病及進展關系密切[6]。目前關于宮頸癌組織中PAK1、Spred1表達變化相關報道較少。我們檢測了宮頸鱗癌組織PAK1、Spred1表達，并分析其與宮頸癌患者臨床病理參數的關系?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年1月～2015年12月河南科技大學第一附屬醫院手術及活檢的宮頸組織標本154例，納入標準：①術前3月內未接收藥物治療；②術前均未接受放療、新輔助化療和中藥治療；③臨床病理資料完整、病例信息完整者。154例患者中年齡24～68歲，中位年齡50歲；高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染80例；其中宮頸上皮內瘤變Ⅰ級(CINⅠ)、宮頸上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ級(CINⅡ～Ⅲ)患者分別為24、31例，經組織病理檢查確診為宮頸鱗癌患者59例；59例宮頸鱗癌患者中分期(采用2009年FIGO臨床分期)為Ⅰ～Ⅱ期48例、Ⅲ～Ⅳ期11例，分化程度為中-低分化22例、高分化37 例，無淋巴結轉移19例、有淋巴結轉移29例；因非宮頸疾病行全子宮全切的正常宮頸組織標本40例為對照，中位年齡49歲。不同宮頸病變程度納入者年齡具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準同意，納入者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 試劑與方法 兔抗人PAK1多克隆抗體bs-2277R、兔抗人Spred1多克隆抗體bs-17685R、 DAB 顯色試劑盒(試劑均購于北京博奧森生物技術有限公司)。兔抗人PAK1多克隆抗體1:50倍稀釋、兔抗人Spred1多克隆抗體1∶75倍稀釋)；采用免疫組化法檢測，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作，陰性對照一抗使用PBS緩沖液替代，用已知陽性病理切片作為陽性對照。

1.3 宮頸鱗癌組織PAK1及Spred1檢測 采用免疫組化法。所有操作均要嚴格按照試劑盒說明書進行。采用雙盲法請2位專業病理科醫師閱片。PAK1及Spred1均定位于胞質，呈棕黃色顆粒。按著色強度和陽性細胞數綜合計算[7]，著色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；每個高倍鏡視野計數100個細胞，隨機觀察10個視野，取各視野中陽性數平均值作為最終陽性細胞數，陰性為0分，<10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；著色強度和陽性細胞數相乘結果作為最終評分，≤3分判定為陰性，>3分判定為陽性。計算陽性表達率(陽性例數/總例數×100%)。

1.4 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件進行統計學處理。計數資料用%表示，比較用χ2檢驗或Fisher精確概率法統計；PAK1及Spred1表達的相關性采用Spearman相關性分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸鱗癌組織PAK1、Spred1陽性表達率比較 CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸鱗癌、正常宮頸組織PAK1的陽性表達率分別為29.17%(7/24)、58.06%(18/31)、81.36%(48/59)、17.50%(7/40)，與正常宮頸、CINⅠ組織比較，CINⅡ～Ⅲ、宮頸鱗癌組織PAK1的陽性表達率升高(P均<0.05)，與CINⅡ～Ⅲ組織比較，宮頸鱗癌組織PAK1的陽性表達率升高(P<0.05)。 CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸鱗癌、正常宮頸組織Spred1的陽性表達率分別為70.08%(17/24)、32.26%(10/31)、13.55%(8/59)、90.00%(36/40)，與正常宮頸組織比較，CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸鱗癌組織Spred1的陽性表達率降低(P均<0.05)，與CINⅠ組織比較，CINⅡ～Ⅲ、宮頸鱗癌組織Spred1的陽性表達率降低(P均<0.05)，與CINⅡ～Ⅲ組織比較，宮頸鱗癌組織Spred1的陽性表達率降低(P<0.05)。

2.2 PAK1、Spred1表達與宮頸鱗癌患者臨床病理參數的關系 PAK1蛋白表達與宮頸鱗癌患者病理分級、有無淋巴轉移有關(P均<0.05)。Spred1蛋白表達與宮頸鱗癌患者病理分級有關(P<0.05)。見表1。

表1 PAK1、Spred1表達與宮頸鱗癌臨床病理參數的關系(例)

2.3 不同病變程度宮頸組織PAK1和Spred1表達相關性及其與高危型HPV感染的關系 相關性分析結果顯示，不同病變程度宮頸組織PAK1與Spred1表達呈負相關(r=-0.440，P=0.000)。

不同病變程度宮頸組織PAK1與與高危型HPV感染呈正相關(r=+0.206，-2.16；P<0.05)，不同病變程度宮頸組織Spred1表達與高危型HPV感染呈負相關(r=-2.16；P<0.05)。

3 討論

近些年隨著利妥昔單抗(Mabthera)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、 吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)等分子靶向藥物的臨床應用，有部分腫瘤患者從中明顯受益，但仍有大部分患者并未取得較好的療效，因此，探索研究靶向治療敏感的分子信號通路網仍是腫瘤治療領域內的熱點及難點問題。

P21 活化的激酶(p21-activated kinase，PAK)家族，是一類進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在信號傳導通路中它是Rho家族下游的靶蛋白和MAPK上游的調節蛋白[5，8,9]，PAK家族成員根據其結構的異同可分為兩大類，PAKⅠ類包括PAK1-3，主要通過結合CDC42 或Rac1被激活；PAKⅡ 類包括PAK4-6，可與CDC42結合但卻不能使其被激活。PAK家族與食管癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤的發展與侵襲有關。腫瘤細胞的生長和轉移與多種因素相關PAK可以促進平滑肌細胞的增值和病理性血管的形成和重構，此研究證實了PAK家族在腫瘤病理性血管生成過程中的重要作用。PAK1是PAK家族最早發現且研究最多的成員，PAK1在細胞形成、運動和增殖等調節中起重要作用[10]。Chow等[11]報道 PAKl的表達與人鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)的分期和分級密切相關。在信號通路中PAK1是MAPK上游的調控因子，而根據現有研究已知，MAPK信號通路在多種腫瘤的發生發展過程中發揮了重要作用[12]。在宮頸癌中的發生發展中，MAPK途徑的激活與Notch1的失調協同作用導致人乳頭瘤病毒(HPV)驅動的宮頸癌侵襲[13]，Notch1在生物進化上高度保守，其活化形式NICD是多種信號通路的交匯點，Notch1在不同細胞中具有不同作用，在腫瘤的發生發展中，其主要機制是抑制腫瘤細胞的凋亡，從而誘導細胞增值[14]。Ong等[15]研究發現，PAKl抑制劑能夠抑制MAPK信號通路的活化，因此，PAK1與宮頸癌的發病存在潛在關系。PAK1在婦科腫瘤的研究較少，有學者[16]研究PAK1在HeLa細胞中高表達，并且與HeLa細胞的增殖密切相關。

Spred蛋白家族是酪氨酸激酶結合蛋白[6]，可作用于多條信號通路，能夠抑制多種刺激物誘導的Erk的激活，從而對細胞的生長和發育起負調控作用。Spred1定位于人基因的15q13.2上，可以特異性地抑制MAPK信號通路，但其作用位點目前尚不明確[17]。Spredl在RhoA介導的細胞運動及信號轉導的調控中起關鍵作用，可抑制RhoA的活化，并且還可以與活化的RhoA結合，抑制其誘導的Rho激酶的激活。Miyoshi 等[18]研究指出：將Spred1基因和載體病毒整合并注入到試驗大鼠體內，腫瘤的生長可被明顯抑制，由此可推斷，Spred1的高表達可減弱腫瘤組織的增殖能力。

本研究結果顯示，在正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宮頸癌組中，PAK1隨著宮頸病變程度的加重陽性表達率升高，而PAK1蛋白的正常組與CINI組差異無統計學意義，提示宮頸病變CINⅠ可向正常組織轉化；其余各組PAK1陽性表達率間差異均有統計學意義；而Spred1陽性表達率隨宮頸病變程度的加重降低，提示PAK1與Spred1的表達與宮頸癌的發生發展有關，相關性分析結果顯示，不同病變程度宮頸組織PAK1與Spred1表達呈負相關。說明在不同程度宮頸病變組織中可能出現了Spred1基因突變，使Spred1功能下調，從而對PAK家族的負調控作用減弱，引起PAK家族表達的上調，從而引起其下游蛋白MAPK作用的上調，導致宮頸癌的發生發展。目前研究表明信號通路Spred1/PAK1/MAPK信號通路與宮頸癌的發生發展存在相關性。其原因可能為在Spred1/PAK1/MAPK信號通路中，Spred1為抑癌基因，PAK1為促癌基因，兩因子的調控呈負相關參與調節宮頸鱗癌的發生與發展；兩者在信號通路中均與MAPK相關聯，具體信號機制的作用靶點有仍待進一步研究探討。或許上調Spred1為靶向蛋白，或抑制PAK1的活化，從而抑制MAPK信號通路的活化。PAK1蛋白表達與宮頸鱗癌的病理分級、淋巴轉移有關，與年齡、臨床分期無關；Spred1蛋白表達與宮頸鱗癌的病理分級有關，與年齡、病理分級、臨床分期無關；由于Ⅲ～Ⅳ級宮頸鱗癌樣本量僅11例，可能存在結果的偏差，需進一步擴大樣本含量。

PAK1與Spred1高危型HPV感染的相關性分析可知不同病變程度宮頸組織PAK1與與高危型HPV感染呈正相關，不同病變程度宮頸組織Spred1表達與高危型HPV感染呈負相關。在宮頸鱗癌中，高危型HPV感染與PAK1共同促進宮頸鱗癌的發病及進展，因此治療高危型HPV感染可有效預防宮頸鱗癌發生。

綜上所述，與正常宮頸組織相比，宮頸上皮內瘤變宮、頸鱗癌組織中PAK1表達升高、Spred1表達降低；隨宮頸病變程度加重，宮頸組織PAK1表達升高、Spred1表達降低。PAK1與Spred1呈負調控作用，在宮頸鱗癌的發生、發展中發揮重要作用。