徐哲,劉亞軍, 鄢程程,丁藝,何婷婷,張福,高清川

(廣元市中心醫院，四川廣元628000)

據統計，全球的兒童哮喘發病率逐年上升[1]。根據2014年全球哮喘防治創議委員會調查研究表明[2]，≤5歲兒童哮喘的病因復雜，其發病的病理生理學機制亦尚未徹底清楚，可能與內分泌因素、神經、免疫精神和遺傳學背景等密切相關。目前的觀點[3]是遺傳和環境因素相互作用共同導致哮喘的發展和演變。國外早期的全基因組關聯研究(GWAS)[4]已確定多個染色體位點與哮喘相關，且多項關于候選基因變異與哮喘風險的相關性研究[5]提出了多種易感基因。最新GWAS研究[6]發現，白介素1受體1(Interleukin 1 receptor-like 1, IL1RL1)基因是哮喘的易感基因。進一步研究[7]發現，漢族哮喘患者血清L1RL1水平升高，且該易感基因的RS1558641位點與過敏性哮喘發生發展有關。我們前期基于Hapmap數據庫(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得的IL1RL1基因組遺傳變異資料，采用Haploview軟件確定其多態位點的分布頻率，利用Tagger功能，按照在中國人群中最下等位基因頻率>5%，并且與區段內其他單核苷酸多態性(SNP)的連鎖不平衡系數均>0.8的原則，最終篩選出RS1041973、RS1020893位點可能與過敏性哮喘有關。但嬰幼兒哮喘與IL1RL1基因中RS1041973、RS1020893位點的相關性研究較少。我們觀察了支氣管哮喘患兒IL1RL1基因RS1041973、RS1020893位點的SNP，旨在為嬰幼兒支氣管哮喘的病理生理學機制提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機選取2012年1月～2015年1月在廣元市中心醫院兒科門診及住院確診為支氣管哮喘[8]的患兒86例為哮喘組，其中男49 例，女37例，年齡5月～3(1.49 ± 0.70) 歲。同時隨機選取同時體檢的健康兒童100例為對照組，其中男50例，女50例，年齡 3 月～3 (1.52 ± 0.85)歲。兩組年齡、性別比例具有可比性。兩組納入對象均排除既往有心肺、肝病或腎病疾患，過敏性疾患及其他變態反應性疾患史，免疫性疾病史和慢性疾病史，近四周無感染及服藥史。本研究通過廣元市中心醫院倫理委員會審核批準，納入患兒家長均簽署知情同意書。

1.2 兩組IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點基因型及等位基因分析方法 抽取兩組空腹靜脈血2 mL，3 000 r/min離心5 min。采用天根血液DNA提取試劑盒(DP348)，參照試劑盒說明書，提取血液DNA，-70 ℃保存備用。利用探針、引物找到其IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點并對其進行擴增，采用ARMS-qPCR法對其基因位點行基因分型檢測。設計引物、探針及利用Primer Premer6軟件設計擴增引物由上海捷瑞生物公司合成，所有引物及探針可見表1、2。

表1 IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點基本信息、引物及探針序列

表2 IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點測序引物序列

熒光定量PCR結合特異性ARMS引物和探針，檢測IL1RL1基因RS1041973、RS10208293位點的基因型以及等位基因的表達情況。熒光定量PCR 反應條件為:95 ℃ 3 min， 40個循環：94℃ 10 s，60 ℃ 40 s。RS1041973 位點A/C基因型測序結果包括AA、AC、CC三種基因型，RS10208293位點A/G基因型測序結果包括AA、AG、GG三個基因型。

1.3 兩組血清IL1RL1、IgE檢測 采用ELISA法。抽取兩組空腹靜脈血2 mL，3 000 r/min離心5 min，取血清。人血IL1RL1定量免疫試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，參照其試劑盒說明檢測兩組血清IL1RL1。人IgE定量免疫試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，參照其試劑盒說明檢測兩組血清IgE。

2 結果

哮喘組IL1RL1基因RS1041973位點基因型AA、AC、CC的分布頻率分別為3.5%(3/86)、23.3%(20/86)、73.2%(63/86)，等位基因A、C的分布頻率分別為15.2%(26/172)、84.8%(146/172)；對照組分別為8.0%(8/100)、26.0%(26/100)、66.0%(66/100)、21%(42/200)、79%(158/200)；兩組AC、CC基因型分布頻率及等位基因A、C的分布頻率差異存在統計學意義(P均<0.05)。與RS1041973位點基因型AA基因人群比較，RS1041973位點AC、CC基因型的個體患哮喘的風險性增加(校正OR=1.769，2.212；95%CI：0.47～6.655，0.637～7.687)；且攜帶C等位基因的個體患哮喘的危險度是A基因的1.506倍(95%CI：0.726～3.126，P<0.05)。

哮喘組IL1RL1基因RS10208293位點基因型AA、AG、GG的分布頻率分別為4.6%(4/86)、25.6%(22/86)、69.8%(60/86)，等位基因A、G的分布頻率分別為17.4%(30/172)、82.6%(142/172)；對照組分別為7.0%(7/100)、29.0%(29/100)、64.0%(64/100)、21.5%(43/200)、78.5%(157/200)；兩組AG、GG基因型分布頻率及等位基因A、G的分布頻率差異存在統計學意義(P均<0.05)。與RS10208293位點基因型AA基因人群比較，RS10208293位點AG、GG基因型的個體患哮喘的風險性增加(校正OR=1.255，1.531；95%CI：0.355～-4.442，0.463～ 5.067)；且攜帶G等位基因的個體患哮喘的危險度是A基因的1.36倍(95%CI：0.673～2.749，P<0.05)。

哮喘組、對照組血清IL1R1分別為(78.32±53.32)、(67.36 ±36.73)ng/mL(P<0.05)；哮喘組、對照組血清IgE分別為(140.87±65.32)、(87.84±45.22)ng/mL(P<0.05)。

3 討論

炎癥免疫反應在支氣管哮喘發病中的作用機制一直是備受關注的焦點。研究[9]發現,Th2細胞在支氣管哮喘的炎癥反應過程中發揮了及其重要的作用。IL1RL1基因定位于2號染色體上，最早從BALB/c-3T3細胞系中得到IL1RL1基因，其結構與IL-1受體(IL-1R)相似，具有 Toll/IL-1R的結構域，同時主要表達于肺動脈內皮細胞、支氣管上皮細胞、肥大細胞、T淋巴細胞和TH2細胞。以往研究[10]證實在不同人群中 IL1RL1 基因與哮喘的發病風險相關。

IL1RL1 基因編碼位于 TH2 細胞和調節性T 細胞受體。IL1RL1可特異性識別并結合IL-33，兩者相互作用，借助IL-1 輔助受體蛋白( IL-1RAcP)而形成IL-33/ IL1RL1復合物[11]。胞膜上IL1RL1和 IL-1RAcP 可組合形成異二聚體，通過與IL-33 結合，將信號轉導至胞內并激活下游絲裂原活化蛋白激酶( MAPKK) ，導致 NF-κB 從復合物中釋放出來，最終激活Th2 細胞因子，促Th2細胞因子過表達，啟動炎癥反應的發生[13]。本研究結果發現，在支氣管哮喘患兒中IL-33的過表達和IL1RL1過表達同時存在，進一步證實了IL-33/ IL1RL1復合物激活的信號通路在哮喘中具有舉足輕重的作用。IL-33/IL1RL1通路多態性與哮喘表型相關聯。以上研究結果均提示，阻斷IL-33/IL1RL1 信號通路可減少TH2細胞因子的激活，減輕炎癥反應以達到治療哮喘的效果。

支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥，TH2細胞因子的活化是其病理生理學基礎[13]，IL-33/ IL1RL1復合物可以將信號轉導至胞內激活MAPKK，導致NF-κB的釋放，激活Th2 細胞因子，促進Th2細胞因子過表達，從而導致Th2高表達，Th2高表達型通常表現為血清IgE的增高[14]，從而導致炎癥反應的發生。本研究發現，哮喘組血清IL1RL1和IgE的水平明顯高于對照組，提示IL1RL1表達與血清IgE表達可能具有一定的關系。

RS1041973 位點位于IL1RL1基因的三號外顯子上，為非同義突變，其突變可導致細胞膜外部區域的IL1RL1蛋白特定位點的谷氨酸突變為丙氨酸，其結果是使負電荷的氨基酸突變為中性氨基酸，從而導致在細胞外免疫球蛋白樣結構域的構象改變[15]。RS1041973位點A>C,在哮喘患兒中分布增多，且IL1RL1蛋白的血清含量明顯增多，同樣也說明該位點的突變可能與IL1RL1基因的過表達相關，過度激活IL-33/ IL1RL1信號通路，導致呼吸道的過敏反應，進而引發嬰幼兒的哮喘發作。RS10208293位點位于IL1RL1基因的內含子區域，實驗研究發現該位點的A>G,也與IL1RL1表達量增高相關，推測可能的原因為該位點與調節該基因轉錄翻譯的位點存在連鎖效應，但進一步的分子機制有待研究。

本研究結果發現，與對照組比較，哮喘組IL1RL1基因RS1041973位點基因型AC、CC的分布頻率高。RS1041973的基因型位點中的AA、AC、CC這三種基因型，AA基因型不增加哮喘發生危險，AA基因型的OR值為1，而AC、CC基因型均可增加哮喘發生的危險性，在RS1041973的等位基因型A和C中，A等位基因不能使哮喘的患病風險增高，A等位基因的OR值為1，而C等位基因可能提示患病風險增高，說明與RS1041973位點基因型AA基因人群比較，RS1041973位點AC、CC基因型的個體患哮喘的風險性增加；且攜帶C等位基因的個體患哮喘的危險度是A基因的1.506倍。與對照組比較，哮喘組IL1RL1基因RS1041973位點基因型AG、GG的分布頻率高。在RS102082933的基因型位點中的AA、AG、GG這三種基因型，AA基因型不能增加哮喘發生的危險性，AA基因型的OR值為1，而 AG 和GG 基因型均能增加哮喘發生的危險性，RS102082933位點等位基因型A和G中，A等位基因不能使哮喘的患病風險增高，A等位基因的OR值為1，而G等位基因可能提示患病風險增高，提示與RS10208293位點基因型AA基因人群比較，RS10208293位點AG、GG基因型的個體患哮喘的風險性增加；且攜帶G等位基因的個體患哮喘的危險度是A基因的1.36倍。

綜上所述，支氣管哮喘患兒IL1RL1基因RS1041973位點基因型AC、CC的分布頻率高，C等位基因突變頻率高；RS10208293位點基因型AG、GG的分布頻率高，G等位基因突變頻率較高。IL1RL1基因RS1041973位點A/C的C等位基因、RS10208293位點A/G的G等位基因可能與支氣管哮喘的易感性有關。支氣管哮喘患兒血清IL1RL1、IgE均水平增高，IL1RL1、IgE可能通過過度激活TH2細胞因子，在支氣管哮喘的發生發展中發揮重要作用。