重組腺病毒Ad-TSHR289注射誘導(dǎo)Graves病小鼠模型

湯陽(yáng)，朱曉云，馮慧，付守強(qiáng)，劉喜明

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 10053)

Graves病(GD)是一種以甲狀腺?gòu)浡阅[大與功能亢進(jìn)為特征的內(nèi)分泌疾病[1]。血清T4、促甲狀腺素受體抗體(TRAb)是目前臨床常用的GD實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。目前GD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，構(gòu)建符合疾病特征的動(dòng)物模型對(duì)研究GD的機(jī)制和治療手段具有重要意義[2, 3]。模型是研究疾病機(jī)制的重要載體。內(nèi)分泌疾病模型普遍造模時(shí)間長(zhǎng)，導(dǎo)致研究效率低下。過(guò)表達(dá)人促甲狀腺激素受體(TSHR)A亞單位的腺病毒(Ad-TSHR289)誘導(dǎo)的GD小鼠模型具有成模率高、重復(fù)性強(qiáng)等特點(diǎn)，向小鼠體內(nèi)間斷注射Ad-TSHR289腺病毒3次，造模第10周即可鑒定GD成模情況，是目前應(yīng)用最為廣泛的造模方法[4, 5]。本課題組前期采用多次注射5.62×107Pfu重組病毒量免疫BALB/c小鼠成功構(gòu)建GD模型，造模時(shí)間接近3個(gè)月，嚴(yán)重影響研究效率。減少Ad-TSHR289免疫頻次、提前鑒定是否影響GD成模？2018年3～7月，我們觀察了2×109Pfu的Ad-TSHR289兩次注射誘導(dǎo)GD模型效果。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、重組腺病毒、試劑及儀器 6～8周齡、體質(zhì)量18～20 g的SPF級(jí)別BALB/c雌性小鼠36只購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，編號(hào)為SYXK(京)2014-0041。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由攝食攝水，明暗12 h/12 h，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)。含人TSHR-A亞單位全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒pSV2neoECE-TSHR289-6H-dhfr由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)的Basil Rapoport教授惠贈(zèng)；參照病毒制備方法[11]構(gòu)建并優(yōu)化，構(gòu)建pAdCMV_TSHR289/Flag_mPGK_DsRedexpress2腺病毒表達(dá)載體(Ad-TSHR289)，質(zhì)粒擴(kuò)增、腺病毒構(gòu)建、包裝純化、鑒定病毒轉(zhuǎn)染力等均由北京東華紡生物有限公司進(jìn)行。促甲狀腺受體抗體檢測(cè)試劑盒(Anti-TSHR，TRAb)購(gòu)自美國(guó)羅氏；四碘甲狀腺原氨酸試劑盒(T4)購(gòu)自德國(guó)拜耳。倒置顯微鏡購(gòu)自日本尼康；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(ADVIA centaur CP)購(gòu)自西門(mén)子，電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)(Cobas e 601)購(gòu)自美國(guó)羅氏。

1.2 BALB/c小鼠小鼠分組及GD病小鼠模型造模 36只BALB/c小鼠，分為模型組(GD組)、正常對(duì)照組(NC組)，每組各18只。GD組分別于第1、4周小鼠脛前肌注射含2×109Pfu優(yōu)化Ad-TSHR289腺病毒的PBS溶液；NC組分別于同時(shí)同部位注射等量PBS溶液。

2 結(jié)果

造模第7、13、18周兩組小鼠血清T4、TRAb含量比較見(jiàn)表1。第7、13、18周GD組成模數(shù)分別為6、6、6。

表1 造模第7、13、18周兩組小鼠血清T4、TRAb含量比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與本組第7周比較，#P<0.05。

在第7、13、18周可見(jiàn)，GD組小鼠甲狀腺不同程度腫大、充血。HE染色后，NC組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞呈扁平狀，濾泡腔光滑，腔內(nèi)充滿(mǎn)均勻膠質(zhì)。GD組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞肥大，細(xì)胞呈高柱狀，排列緊密，增生的細(xì)胞向?yàn)V泡腔內(nèi)形成乳頭狀凸起，濾泡腔不光滑，腔內(nèi)膠質(zhì)明顯減少、內(nèi)含物增加，甲狀腺組織內(nèi)紅細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，未觀察到明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。隨時(shí)間推移，甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生程度逐漸加重，濾泡腔逐漸變小。

3 討論

GD是最常見(jiàn)的自身免疫性甲狀腺疾病，世界范圍內(nèi)約有3%女性和0.5%男性是GD患者[1]。抗甲狀腺藥物、放射碘以及手術(shù)等是當(dāng)前治療GD的主要形式，但存在復(fù)發(fā)率高、造成甲狀腺功能減退等并發(fā)癥的缺陷。如何有效防治GD仍是學(xué)界難題。因此，探索符合GD臨床特征與病理機(jī)制的動(dòng)物模型是進(jìn)一步研究本病的重要環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的TSHR受體被激活造成甲狀腺的免疫失調(diào)是GD的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制。甲狀腺功能亢進(jìn)和甲狀腺?gòu)浡阅[大是GD關(guān)鍵特征[6]。重組腺病毒Ad-TSHR289構(gòu)建的動(dòng)物模型具備了良好的疾病特征，是當(dāng)前研究GD的重要載體。但其造模時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月，一定程度上限制了本病的研究效率。本研究采用優(yōu)化后的重組腺病毒2次免疫的方式構(gòu)建GD動(dòng)物模型從第7周起T4和TRAb的水平顯著提高，甲狀腺腫大明顯并伴有甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生，從而證實(shí)該方法2次免疫即可于第7周成模，比以往3次免疫法10周成模縮短3周。

成模率是評(píng)價(jià)模型穩(wěn)定性的核心指標(biāo)。盡管重組腺病毒誘導(dǎo)的GD模型是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的造模方法，但在2002年模型建立初期其成模率僅為50%～60%[4]。優(yōu)化造模方法提高成模率成為研究方向。一方面，采用多種造模方式相結(jié)合的手段是一種較為成功的方法，如通過(guò)腺病毒免疫與電穿孔相結(jié)合的方式[7, 8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)腺病毒免疫與電穿孔聯(lián)合法構(gòu)建的動(dòng)物模型的成模率能達(dá)到80%以上，并伴有不同程度的GD眼病特征，成為了諸多學(xué)者探索的方向之一[9]。伍麗萍等[10]報(bào)道稱(chēng)通過(guò)3次免疫法，第10周檢測(cè)成模率可達(dá)到75%。2013年我們首次應(yīng)用Ad-TSHR289免疫法構(gòu)建GD模型，第10周成模率可達(dá)70%[11]。2017年我們采用3次免疫法第10周檢測(cè)小鼠成模情況，發(fā)現(xiàn)9/9達(dá)到成模指征[12]。因此，Ad-TSHR289免疫法構(gòu)建的GD模型是具有穩(wěn)定性強(qiáng)、成模率高等特點(diǎn)，是當(dāng)前應(yīng)用最為普遍的造模方式之一。而本研究顯示，在第7、13、18周，GD組小鼠眼球血清T4、TRAb水平及甲狀腺腫大特征均改變，符合GD臨床特征，均達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)。模型的維持時(shí)間是衡量模型成功性的另一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，需較高水平的TRAb的維持。外源性持續(xù)注入相關(guān)抗原是維持小鼠體內(nèi)TRAb含量的關(guān)鍵途徑，而多次有規(guī)律地重復(fù)免疫是延長(zhǎng)模型特征時(shí)間的重要手段[2]。伍麗萍等[10]發(fā)現(xiàn)腺病毒免疫構(gòu)建的模型最佳時(shí)期為第10周，可維持至第18周。Holthoff等[13]則在常規(guī)造模方法上進(jìn)行改進(jìn)，每3到4周的進(jìn)行1次免疫，連續(xù)免疫9次，觀察到模型維持時(shí)間，發(fā)現(xiàn)模型維持時(shí)間可達(dá)到9個(gè)月，是當(dāng)前報(bào)道的本模型的最長(zhǎng)維持時(shí)間。本研究發(fā)現(xiàn)，GD組T4含量在第7、13、18周均維持在較高水平，第13周時(shí)T4含量絕對(duì)值稍微降低，第18周回升，其可能與非同一批次檢測(cè)造成的誤差有關(guān)。TRAb水平第7周最高，至13周出現(xiàn)了明顯降低，可能與減少了外源性的刺激相關(guān)；第18周較13周，TRAb水平雖然進(jìn)一步降低，但并不顯著。持續(xù)的外源性免疫刺激可能并非是維持GD小鼠體內(nèi)TRAb含量相對(duì)衡定的唯一途徑。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠抑制T細(xì)胞與B細(xì)胞的活性從而維持機(jī)體免疫耐受[14]。GD是一類(lèi)免疫耐受缺失導(dǎo)致的T細(xì)胞與B細(xì)胞主導(dǎo)型的自身免疫性疾病[15]，而B(niǎo)細(xì)胞又是刺激產(chǎn)生TRAb的重要因子[16]。因此，機(jī)體免疫失調(diào)后的內(nèi)源性反應(yīng)可能是產(chǎn)生TRAb的另一途徑。但甲狀腺組織病理并未見(jiàn)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)源性的TRAb途徑仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)，在第18周，模型組血清T4、TRAb保持在一個(gè)較高水平同時(shí)甲狀腺腫大仍舊明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，本方法構(gòu)建的GD模型具有以下體征：①成模時(shí)間早：通過(guò)2次免疫，于第1次免疫后第7周開(kāi)始檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其血清學(xué)指標(biāo)與病理形態(tài)均有顯著變化，即可判斷成模；②成模率高：GD組全部小鼠血清中T4、TRAb在各個(gè)階段均保持較高水平并伴有甲狀腺腫大，進(jìn)而推測(cè)成模率接近100%，但具體成模情況仍需大樣本驗(yàn)證；③維持時(shí)間長(zhǎng)：在第7周成模的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察模型的維持情況，發(fā)現(xiàn)至第18周重組腺病毒免疫的小鼠GD特征仍明顯，并且各項(xiàng)指標(biāo)并無(wú)明顯下降趨勢(shì)。

減少免疫頻次縮短成模時(shí)間，并未影響成模率與模型維持時(shí)間。病毒免疫量是影響模型成功率的重要因素。報(bào)道稱(chēng)注射高劑量的重組腺病毒能使T4更早處于較高水平，并維持更長(zhǎng)時(shí)間[13]。早期利用Ad-TSHR289病毒構(gòu)建GD模型單次所用劑量為5×107IU，模型在第10周為最佳水平，可維持至18周。因此，本研究中以2×109Pfu(約2.8×109IU)為單次注射量，在病毒注射總量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前者。重組腺病毒技術(shù)目前已更新至第三代，侵染力與結(jié)合力均更強(qiáng)[17]。

綜上所述，2×109Pfu的Ad-TSHR289兩次注射BALB/c小鼠第7周時(shí)即可成功構(gòu)建GD模型，成模率和維持時(shí)間均較好。今后將進(jìn)一步延長(zhǎng)觀察本模型的維持時(shí)間以及其他疾病特征(如甲狀腺眼病等)，以期為研究GD提供一個(gè)高效、穩(wěn)定的載體。