多囊卵巢綜合征患者血清外泌體中差異表達microRNAs及其功能分析

王潔，王倩，崔趁趁，牛力華，梁琳琳，張翠蓮

(鄭州大學人民醫院·河南省人民醫院，鄭州450003)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是育齡期女性常見的一種生殖內分泌紊亂性疾病，發病率高達5%～10%[1]。PCOS主要臨床癥狀為月經異常(稀發或閉經)、多毛、痤瘡、肥胖、不孕等，遠期并發癥包括高血壓、高血脂及心血管疾病、糖尿病等，嚴重危害女性的身心健康[2]。目前PCOS的發病機制尚不明確，探索PCOS的發病機制已成為生殖醫學領域研究的熱點。外泌體是細胞通過胞吞胞吐作用分泌的一種膜性囊泡，廣泛分布于血清、血漿、卵泡液、唾液、尿液、乳汁、腹水等多種體液中，直徑30～250 nm[3]。外泌體包含mRNA、microRNAs(miRNAs)、長鏈非編碼RNAs、蛋白質、脂質等多種生物活性物質[4]。作為一種新型的細胞間溝通媒介，外泌體可通過將蛋白質、mRNA和miRNAs等分子傳遞到靶細胞中而在細胞通訊過程中發揮重要作用。目前關于PCOS患者血清外泌體miRNAs表達情況相關報道較少。2017年11月～2018年6月，我們分析了PCOS患者血清外泌體中差異表達miRNAs，并進一步分析血清外泌體中差異表達miRNAs的功能，以期為PCOS發病機制的研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇河南省人民醫院生殖醫學中心行體外受精—胚胎移植(IVF-ET)助孕的患者，據鹿特丹標準診斷為PCOS患者30例為實驗組，年齡(28.27±2.77)歲。納入標準：年齡<35歲，雙側竇卵泡數>5～7個，既往6個月內未行激素替代治療，排除糖尿病、高胰島素血癥、庫欣綜合征、甲狀腺功能障礙、高泌乳素血癥等內分泌疾病。因單純輸卵管因素不孕的患者30例為對照組，年齡(29.27±2.88)歲。兩組年齡等一般資料具有可比性。本研究經河南省人民醫院倫理委員會批準，納入者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 ExoquickTM外泌體提取試劑盒(SBI，美國)，RNeasy Mini Kit試劑盒(Qiagen，德國)，miScript PCR Starter Kit試劑盒(Qiagen，德國)，兔CD63抗體(abcam，英國)，兔CD9抗體(Abcam，英國)，兔α-tubulin抗體(Abcam，英國)，抗兔二抗(Abcam，英國)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，透射電子顯微鏡(JEOL，日本)，qRT-PCR儀(Roche，瑞士)。

1.3 兩組血清外泌體提取 兩組分別于月經周期第2～4天抽取外周血5 mL，3 000 rpm離心20 min，取血清保存于-80 ℃備用。采用SBI公司的ExoquickTM外泌體提取試劑盒提取外泌體，將500 μL冷凍血清于冰上融化，3 000 g離心15 min去除細胞碎片，按說明書加入外泌體提取試劑，4 ℃靜置30 min，1 500 g離心30 min，去除上清，注意不要觸碰底部沉淀，再次1 500 g離心5 min，去上清，100 μL的PBS重懸，-80 ℃備用。取PBS重懸的外泌體懸液20 μL，滴于載樣銅網上，室溫靜置2 min，用濾紙從濾網側邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液30 μL在室溫下負染5 min，濾紙吸干負染液，白熾燈烤干，將銅網安裝于樣品槽中，透射電鏡拍照觀察。鏡下可見外泌體是直徑30～250 nm的圓形或橢圓形膜性囊泡，有雙層膜性結構，可單個分布，也可成群聚集分布的形態及大小。考馬斯亮藍染色劑染色、Western Blotting法檢測外泌體表面特異性蛋白CD9、CD63，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。結果顯示兩組血清外泌體中均存在CD9、CD63。

1.4 兩組血清外泌體miRNAs檢測及差異表達血清外泌體miRNAs篩選 取兩組外泌體樣品，冰上解凍后，嚴格按照RNeasy Mini Kit試劑盒說明書的操作步驟提取血清外泌體miRNAs，使用華大基因公司的BGISEQ500測序平臺進行質檢。高通量測序法定性、定量檢測兩組血清外泌體miRNAs，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。采用差異檢驗方法(兩組差異表達倍數≥2且P<0.01即可判定為差異表達血清外泌體miRNAs)篩選出兩組差異表達的血清外泌體miRNAs。

1.5 差異表達血清外泌體miRNAs功能分析 將“1.4”中差異表達血清外泌體miRNAs導入富集分析工具Enrichr進行生物信息學分析。對差異表達血清外泌體miRNAs進行GO富集分析及KEGG功能注釋，揭示差異表達血清外泌體miRNAs的功能。

1.6 兩組血清差異表達外泌體miRNAs檢測 最終篩選出10條差異表達血清外泌體miRNAs。取兩組血清，qRT-PCR法檢測差異表達血清外泌體miRNAs。采用miScript PCR Starter Kit試劑盒和 Light Cycler 96 儀器進行 qRT-PCR 定量檢測，實驗采用20 μL反應體系，擴增條件：95 ℃變性15 min，循環條件為95 ℃15 s，55 ℃30 s，70 ℃ 30 s，共進行45個循環。內參基因選用U6，各miRNAs引物序列見表1。以2-△△Ct代表目的miRNAs的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

表1 10種差異性表達miRNAs的引物序列

2 結果

PCOS患者血清外泌體差異表達miRNAs共有243條，其中表達上調115條、下調128條，部分數據見表2。GO分析及KEGG功能注釋結果發現，PCOS患者差異表達血清外泌體miRNAs的功能與類固醇激素的合成有關，可能參與調節胰島素信號受體通路。

實驗組miR-146a-5p、miR-25-5p、miR-27a-3p、miR-93-5p、miR-23a-3p、miR-223-5p、miR-25-3p、miR-483-5p、miR-383-5p相對表達量分別為5.970±0.370、11.150±0.150、6.423±0.198、6.085±0.115、2.794±0.094、9.970±0.470、1.900±0.100、8.398±0.343、8.320±0.420，對照組分別為3.500±0.420、9.645±0.145、4.220±0.190、3.750±0.050、0.424±0.024、6.110±0.110、-0.055±0.015、4.423±0.248、4.435±0.235，組間比較，P均<0.05。實驗組、對照組miR-141-3p相對表達量分別為8.993±0.008、8.993±0.008(P>0.05)。

3 討論

miRNA是廣泛存在于真核生物中的一種短鏈非編碼RNA，可被微囊泡包裹也可以游離存在[5]。miRNA主要在轉錄后與下游靶基因結合，降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯，因此在調控發育過程中起著重要作用。研究[6]表明，miRNA表達改變可能會參與PCOS疾病的發生過程，在一定程度上會影響患者卵母細胞質量，可造成不孕及引發后續不良助孕結局。外泌體可在細胞間傳遞生物學信息，實現細胞間的物質交換和信號交流。外泌體囊泡結構可保護其中的miRNAs，防止其降解而維持其在血液中的生物學穩定性，并可選擇性的傳遞miRNAs至靶細胞中，改變受體細胞基因的表達[5]。研究[7,8]表明外泌體及其miRNAs在腫瘤等疾病的早期診斷和分子機制中發揮著重要的作用。本研究從外泌體的角度出發，研究了miRNA在PCOS的發生發展中可能發揮的作用。

表2 兩組差異表達血清外泌體miRNA比較

本研究主要以血清外泌體miRNAs為研究對象，采用透射電鏡和Western blotting法對外泌體的形態及表面特異性蛋白分子進行鑒定，經檢測發現采用ExoquickTM試劑盒于血清中分離出的提取物符合文獻[6,9]對外泌體形態及特征的描述。根據高通量測序結果及miRNAs的功能[10～13]篩選出hsa-miR-141-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-25-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-383-5p等10條差異性表達miRNAs進行進一步驗證。研究[14,15]認為，以上miRNAs可能與胰島素抵抗的發生、顆粒細胞的增殖凋亡及卵泡激素的合成有關。據報道[10]，miR-146a-5p可參與胰島素信號傳導途徑，通過作用于胰島素受體在脂肪形成的過程中發揮重要的作用；miR-93-5p可以靶向作用于GLUT4，在PCOS患者以及有胰島素抵抗的非PCOS患者脂肪組織中表達上調，這可能會在胰島素抵抗特別是PCOS患者胰島素抵抗的發生中扮演重要的角色[14]。而本研究發現，PCOS患者血清外泌體miR-146a-5p、miR-93-5p相對表達量升高，這可能會為PCOS肥胖和胰島素抵抗發病機制的研究提供新思路。

研究[11]發現，miR-27a-3p，miR-483-5p在PCOS患者顆粒細胞中均表達上調，在調控顆粒細胞增殖凋亡上發揮著重要的作用；進一步將miR-27a-3p轉染KGN細胞系發現miR-27a-3p可以促進KGN顆粒細胞凋亡，抑制其增殖，同時還發現PCOS患者顆粒細胞中miR-27a-3p的過表達可能與其血清睪酮的升高有關。Seger等[12]研究發現PCOS卵丘顆粒細胞中miR-483-5p可作用于MAPK3使其表達下調，從而參與MAPK途徑誘導的顆粒細胞的發育、分化和增殖，還可能負調控PCOS卵泡激素合成。Xu等[6]發現在PCOS患者卵丘顆粒細胞中，高表達的miR-483-5p抑制Notch3和MAPK3蛋白表達，從而阻斷Notch信號通路和MAPK信號途徑，抑制卵丘顆粒細胞增殖、分化，促進顆粒細胞凋亡。研究[13,14]表明miR-23a也在調控細胞凋亡中發揮重要的作用，可以通過抑制XIAP的表達，促進滋養層細胞的凋亡；也可以靶作用于SMAD5促進顆粒細胞的凋亡[15，16]。本研究中PCOS組血清外泌體miR-27a-3p、miR-23a、miR-483-5p相對表達量均上升，可能會在一定程度上調控PCOS患者顆粒細胞的增殖凋亡以及卵泡激素的合成，導致PCOS的發生發展，這將會為我們研究PCOS可能的診斷方法和發病機制提供一定的思路和分子基礎。

綜上所述，PCOS患者血清外泌體hsa-miR-378d、hsa-miR-378b、hsa-miR-4772-3p等表達上調，hsa-miR-5090、hsa-miR-3680-3p、hsa-miR-6836-5p等表達下調。PCOS患者差異表達血清外泌體miRNAs與類固醇激素的合成有關，可參與調節胰島素信號受體通路。