高尿酸血癥患者血清ABCG2基因rs2231142位點單核苷酸多態性觀察

瑪依娜·卡哈爾，余家會，李瑞，張蓓，宋睿睿，孫玉萍

( 1新疆醫科大學基礎醫學院，烏魯木齊 830011 ；2信陽市中心醫院)

隨人類生活水平的提高和飲食結構的改變，以及遺傳和環境因素的改變，世界范圍內高尿酸血癥的發病率逐年增加[1，2]。高尿酸血癥是由于機體血清尿酸生成過多或血尿酸排出減少形成尿酸潴留而導致的一種代謝綜合征。尿酸、腎功能指標檢測結合臨床癥狀是目前臨床常用的預警和預測高尿酸血癥患的方法，但發現時機體已經出現一定程度的病理生理改變，嚴重影響患者預后。遺傳學背景及生物標志物在臨床表型出現變化前即可提供預警信息，使高尿酸血癥的防治關口提前。ABCG2基因定位于人染色體的4q22-q23，大小為67 171 bP，編碼的蛋白含有655個氨基酸殘基，相對分子質量為72 343。三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2(ABCG2) 是一種 ATP 結合轉運蛋白，廣泛分布在具有分泌和排泄功能的組織，其功能異常可導致尿酸排泄能力下降[3]。ABCG2蛋白由6個橫跨膜螺旋結構域和一個單獨的ATP結合域所組成。包含16個外顯子和15個內含子[4]。研究[5]表明ABCG2基因rs2231142位點突變在腎臟尿酸排泌過程中起到重要作用, 該位點突變與尿酸代謝以及腎功能損傷是否存在關聯性？2016年6月～2018年9月，我們檢測了高尿酸血癥患者血清ABCG2基因rs2231142位點SNPs。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012～2016年在新疆醫科大學第一附屬醫院、吐魯番市人民醫院、塔城托里縣人民醫院、喀什地區第一人民醫院體檢中心健康體檢者，按照匹配的原則隨機選取漢族人群1 289例，其相互之間無血緣關系且三代直系親屬在采樣地區居住20年以上，年齡控制范圍為20～60歲。對照組選取來自同一居住區的病例人群，年齡控制范圍為20～70歲，并按照近1∶3的比例進行匹配，最終納入高尿酸血癥患者357例(高尿酸血癥組)、正常對照人群932例(正常組)，所有入選者均自愿參加，并對本研究知情同意。高尿酸血癥診斷標準：男性空腹SUA>417 μmol/L(7 mg/dL)，女性空腹SUA>357 μmol/L(6 mg/dL)。排除標準：①近期服用導致SUA水平上升藥物(噻嗪類利尿劑、阿司匹林、吡嗪酰胺類藥物等)者；②合并嚴重系統疾病；③痛風發作活動期；④近6個月內應用免疫抑制劑者；⑤因嘌呤代謝酶導致的尿酸代謝缺陷。高尿酸血癥組年齡(41.1±11.7)歲、身高(168.1±6.7)cm、體質量(70.2±11.5)kg、腰圍(86.4±10.4)cm、臀圍(96.9±7.5)cm、BMI(25.16±0.23)kg/m2、收縮壓(SBP)為(121.7±6.5)mmHg、舒張壓(DBP)為(81.3±8.8)mmHg，高密度脂蛋白(HDL)為(1.3±0.5)mmol/L、總膽固醇(TC)為(4.7±1.4)mmol/L、甘油三酯(TG)為(2.4±1.8)mmol/L，血糖(GLU)(5.5±1.7)mmol/L。正常組年齡(39.5±10.8)歲、身高(166.0±7.7)cm、體質量(69.1±12.3)kg、腰圍(84.1±10.1)cm、臀圍(96.1±8.3)cm、BMI(24.55±0.53)kg/m2、SBP(119.4±6.8)mmHg、DBP(79.5±8.9)mmHg，HDL(1.6±0.4)mmol/L、TC(4.6±1.1)mmol/L、TG(1.5±1.3)mmol/L，GLU(5.1±0.9)mmol/L。兩組年齡、身高、體質量、腰圍、臀圍、BMI、SBP、DBP具有可比性，高尿酸血癥組HDL、TC、TG、GLU等指標均高于正常組(P均<0.05)。本研究經新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準同意。

1.2 兩組血清ABCG2基因rs2231142位點基因檢測分型 抽取兩組晨起空腹靜脈血2 mL，靜置30 min,2 mL EDTA抗凝血后，百泰克核酸提取儀器(BioTeke AU1001)上提取DNA，-20 ℃保存備用。紫外分光光度計檢測基因組DNA的純度和濃度進行檢測，DNA的OD260/OD280在1.6～1.9之間時純度符合要求。-20 ℃冰箱保存備用。PCR法擴增目的基因，ABCG2 mRNA上游引物5′-GAAAGCAACCATTTTTGACCATACACA-3′，下游引物5′-GTGATGGGCACTCTGACGGTGA-3′，均由上海天昊生物工程有限公司合成。PCR反應體系為：DNA模板 1 μL、PCR mix 5 μL 、無DNase的水3 μL、Taqman探針1 μL，反應終體積10 μL。反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，退火30 s,60 ℃延伸1 min，共40次循環。擴增產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增質量。PCR產物純化后送上海天昊生物工程有限公司，采用iMLDR方法分析ABCG2基因rs2231142位點基因型。

1.3 兩組血清SUA及及腎功能指標檢測 收集兩組禁食12 h后的清晨空腹靜脈血4 mL,取2 mL于當日3 500 r/min轉速離心15 min，取其上層血清，按標準方法4 h內由日立7060全自動生化分析儀測定血液生化指標以及SUA、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)等腎功能相關指標,質控合格。參照Kawamoto 等制定的血清SUA分級標準[6]可將高尿酸血癥患者分為1級(SUA1)：SUA≤217 μmol/L；2級(SUA2)：217.01 μmol /L≤SUA≤263 μmol /L；3級(SUA3)：263.01 μmol /L≤SUA≤316 μmol /L；4級(SUA4)：SUA≥316 μmol /L。收集兩組尿液檢測尿尿酸(UA)，參照文獻[7,8]測算兩組腎小球濾過率GFR[mL/(min·(1.73 m2)]=186×(Scr)-1.154×(年齡)-0.203×(0.742女性)。

2 結果

2.1 兩組ABCG2基因rs2231142位點基因型及等位基因比較 高尿酸血癥組ABCG2基因rs2231142位點基因型GG、GT+TT分布頻率分別為42.9%(153/357)、57.1%(204/357)，等位基因G、T的分布頻率分別為65.3%(466/714)、34.7%(248/714)；對照組ABCG2基因rs2231142位點基因型GG、GT+TT分布頻率分別為53.6%(500/932)、46.4%(432/932)，等位基因G、T的分布頻率分別為75.7%(1 346/1 864)、24.3%(518/1 864)；兩組基因型分布及等位基因G、T的分布頻率差異存在統計學意義(χ2=6.518，3.987；P均<0.05)。采用擬和優度χ2檢驗對所測基因型頻數分布進行分析，結果顯示受檢人群ABCG2基因rs2231142位點基因型的頻數分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，可說明納入研究對象具有群體代表性，符合遺傳標記分析。

2.2 兩組SUA、CREA、BUN、UA、sGFR比較 高尿酸血癥組、正常組血清SUA分別為(473.1±12.7)、(259.7±12.4)μmol /L，CREA分別為(88.07±15.7)、(74.2±15.2)mmol/L，BUN分別為(5.5±2.4)、(4.8±1.9)mmol/L，UA分別為(473.1±12.7)、(259.7±12.4)μmol/L，sGFR分別為(96.07±3.5)、(113.2±1.3)mL/(min·1.73 m2)，兩組比較，P均<0.05。

2.3 不同血清SUA水平高尿酸血癥患者 ABCG2基因rs2231142位點基因型及等位基因比較不同血清SUA水平高尿酸血癥患者 ABCG2基因rs2231142位點基因型及等位基因比較見表1。表1可見隨尿酸水平升高，GT+TT分布頻率逐漸升高，GG分布頻率逐漸降低，T等位基因分布逐漸升高, G等位基因分布逐漸降低(P均<0.05)。

表1 不同血清SUA水平高尿酸血癥患者 ABCG2基因rs2231142位點基因型及等位基因比較(%)

2.4 ABCG2基因rs2231142位點基因型與高尿酸血癥的關系及發病風險 ABCG2基因rs2231142位點GT+TT基因型攜帶者罹患高尿酸血癥的風險性是ABCG2基因rs2231142位點GG基因型攜帶者的1.23倍(95%CI為1.101～1.381，P<0.05)，T等位基因攜帶者罹患高尿酸血癥的風險性是G基因型攜帶者的1.43倍(95%CI為1.256～1.628，P<0.05)。

性別、BMI與ABCG2基因rs2231142位點的交互作用差異無統計學意義(95%CI分別為0.26～1.68，0.35～1.68；OR分別為1.47，0.61；P均>0.05)，排除性別和BMI對于ABCG2基因交互作用的影響，而sGFR、SUA與ABCG2基因rs2231142位點之間交互作用差異有統計學意義(95%CI分別為1.34～37.39，1.51～17.86；OR分別為7.43,5.36；P均<0.05)。

2.5 ABCG2基因rs2231142位點不同基因型的高尿酸血癥患者血清SUA、BUN、CREA水平及sGFR比較 ABCG2基因rs2231142位點不同基因型的高尿酸血癥患者血清SUA、BUN、CREA水平及sGFR比較見表2。與ABCG2基因rs2231142位點GG基因型比較，GT基因型高尿酸血癥患者血清SUA、BUN 和CREA水平升高，sGFR降低(P均<0.05)；與GT基因型比較，TT基因型高尿酸血癥患者血清SUA、BUN 和CREA水平升高，sGFR降低(P均<0.05)。

表2 ABCG2基因rs2231142位點不同基因型的高尿酸血癥患者血清SUA、BUN、CREA水平及sGFR比較

3 討論

高尿酸血癥是指細胞外液的尿酸鹽呈超飽和狀態，是以體內嘌呤代謝紊亂、尿酸增高為特征的疾病，可引起痛風和尿酸性腎病。尿酸是嘌呤代謝的終末產物，具有很強的抗氧化性，在保證細胞正常功能方面起著非常重要的作用。隨著人類基因組計劃和基因多態性研究的深入，人們逐漸意識到人類疾病都可能有其特定的基因背景，基因序列上和長度上的變異即SNPs是決定疾病易感性、表型和治療差異的重要因素。高尿酸血癥的發病機制目前尚不清楚，遺傳易感性被認為是一個重要因素。實際上，這種疾病的潛在生物過程涉及基因之間復雜的相互作用、環境和生活方式等因素。因此，識別主要高尿酸易感性基因可以為將來痛風患者的早期分子診斷及靶向治療做出新的貢獻。在全基因組關聯研究中，一些與高尿酸和痛風相關的易感基因被發現,尿酸轉運蛋白變異或表達異常導致尿酸重吸收增加和排泄減少導致高尿酸血癥，但機制尚未闡明。

ABCG2是一種 ATP 結合轉運蛋白，在人體正常細胞以及腫瘤組織中均有表達，近年來有大量研究[9，10]發現ABCG2基因還表達在近曲小管的管腔膜側，與尿酸在腎臟的代謝與外排泄過程有重要作用。ABCG2基因表達與高尿酸血癥以及痛風之間存在較大的關聯[11，12]，其功能紊亂會增加痛風和高尿酸血癥的發病風險[13，14]，而尿酸的升高與腎功能以及其他代謝性疾病密切相關[15～17]。前期有研究發現錯意突變位點Q141K(rs2231142)和Q126X(rs72552713)，認為是原發痛風及高尿酸血癥的易感位點[18，19]。

人體血液中的尿酸從腎小球濾過，其中98%在近曲小管中段又被分泌到腎小球腔內，然后50% 重吸收的尿酸在近曲小管中段又被分泌到腎小管腔內,在近曲小管直段又有40%～44%被重吸收，只有6%～10%尿酸排出。正常人體內尿酸的生成與排泄速度較恒定，可見腎小球濾過對于尿酸的排泄作用密切相關，臨床上用腎小球濾過率表示腎臟功能，故腎小球功能可直接影響到尿酸的排泄[20，21]。

本研究結果發現，隨血清尿酸水平的升高，ABCG2基因rs2231142位點T等位基因分布與GT+TT基因型分布頻率逐漸升高，G等位基因分布與GG基因型分布頻率逐漸降低。本研究還發現高尿酸血癥組與正常組該位點基因型及等位基因頻率之間也有差異，表現出高尿酸血癥組GT+TT基因型和T等位基因頻率高于正常組，而GG基因型分布頻率低于正常組的規律；風險分析顯示攜帶T等位基因的人群罹患高尿酸血癥的相對危險性是攜帶G基因型的1.43倍，攜帶GT+TT基因型的人群罹患高尿酸血癥的相對危險性是攜帶GG基因型人群的1.23倍；排除性別和BMI的混雜影響后，ABCG2基因rs2231142位點與sGFR、尿酸水平存在交互作用；與ABCG2基因rs2231142位點GG基因型比較，GT基因型高尿酸血癥患者血清SUA、BUN 和CREA水平升高，sGFR降低；與GT基因型比較，TT基因型高尿酸血癥患者血清SUA、BUN 和CREA水平升高，sGFR降低，推測原因主要在于腎臟中ABCG2基因的表達在近曲小管上皮細胞頂膜，參與尿酸的分泌轉運，故ABCG2功能異常會降低腎小管對尿酸的排泌，所以高尿酸血癥相對風險性上升的同時導致肌酐清除率下降，腎功能損傷風險也相對增加。

綜上所述，高尿酸血癥患者ABCG2基因rs2231142位點T等位基因突變頻率較高，其與患者sGFR、SUA存在交互作用。ABCG2基因rs2231142位點突變可能在SUA水平升高、肌酐清除率降低中發揮重要作用。