前列腺癌組織中具有潛在生物標(biāo)記物特性的miRNA及其靶基因生物學(xué)功能、信號(hào)通路分析

王金龍，劉芳曉，趙燕云，魏敏杰，何苗

(1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，沈陽(yáng)110122；2遼寧省分子靶向抗腫瘤藥物藥理學(xué)研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)較常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。目前，前列腺癌發(fā)病率位居男性惡性腫瘤的第2位[1]。2015年，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率位居男性腫瘤發(fā)病率第6位，且前列腺癌的發(fā)病率、病死率逐年升高[2]。99%以上的前列腺癌患者為年齡≥50歲的男性[3]。目前，前列腺癌已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)老齡男性健康的惡性疾病。以前臨床主要通過(guò)TNM 分期、Gleason 評(píng)分[4]、血清前列腺特異性抗原(PSA)[5]的表達(dá)及年齡種族等指標(biāo)評(píng)價(jià)前列腺癌患者的預(yù)后，但以上指標(biāo)存在特異度不高、需要過(guò)度穿刺活檢等問(wèn)題。尋找特異度、靈敏度更高的前列腺癌診斷標(biāo)記物已成為目前研究熱點(diǎn)。分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為前列腺癌預(yù)后評(píng)估提供了更可靠、更準(zhǔn)確的判斷依據(jù)[6]。微小RNA(miRNAs)在腫瘤的診斷、治療中應(yīng)用越來(lái)越多[7]。研究[8]證明，miRNAs可通過(guò)結(jié)合3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)負(fù)向調(diào)節(jié)靶mRNA的翻譯，在發(fā)育、分化、代謝[9]及細(xì)胞增殖、凋亡、衰老等細(xì)胞特征和干細(xì)胞維持[10]等各種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。但哪些miRNAs在前列腺癌組織中存在異常表達(dá)，是否可成為前列腺癌生物標(biāo)記物，目前尚不清楚。2018年6～8月，本研究利用癌癥和腫瘤基因圖譜計(jì)劃(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中mRNA數(shù)據(jù)，分析前列腺癌組織、癌旁組織 miRNA的表達(dá)情況， 篩選前列腺癌組織中具有潛在生物標(biāo)記物特征的 miRNA，并分析其靶基因的生物學(xué)功能及信號(hào)通路，旨在為臨床進(jìn)一步驗(yàn)證其是否可成為準(zhǔn)確可靠的前列腺癌預(yù)后標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 前列腺癌組織、癌旁組織miRNAs表達(dá)比較 下載TCGA(https://cancergenome.nih.gov)中前列腺癌高通量測(cè)序表達(dá)譜數(shù)據(jù)及miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)(時(shí)間截止為2018年6月22日)，并通過(guò)R軟件(https://www.r-project.org)對(duì)上述前列腺癌相關(guān)miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，篩選出差異表達(dá)基因(DEGs)，閾值設(shè)為False Discovery Rate錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05，差異表達(dá)倍數(shù)|FC|>1。火山圖橫軸為-Log10(FDR)，值越大表達(dá)差異越顯著；縱軸為L(zhǎng)ogFC，越偏離中心差異表達(dá)倍數(shù)越大。橫軸上方點(diǎn)代表高表達(dá)的miRNA(LogFC>1),橫軸下方綠色的點(diǎn)代表低表達(dá)的miRNA(LogFC<-1)。最終納入52例癌旁組織標(biāo)本和499例前列腺癌組織標(biāo)本。

1.2 前列腺癌組織中高表達(dá)且預(yù)后差 miRNA篩選 使用R語(yǔ)言程序包(edgeR 包)繪制出前列腺癌組織miRNA表達(dá)的熱圖和火山圖，采用Kaplan-Meier生存曲線分析前列腺癌患者的生存情況，篩選出具有潛在生物標(biāo)記物特性(高表達(dá)、預(yù)后差)的miRNA。

1.3 前列腺癌中高表達(dá)、預(yù)后差miRNA的靶基因生物學(xué)功能及信號(hào)通路分析

1.3.1 miRNA靶基因的維恩圖分析 利用在線軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將Targetscan網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_72/)和 miRDB(http://www.mirdb.org)網(wǎng)站，以及DIANA TOOL(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.phpr=site/index)網(wǎng)站中得出的靶基因取交集，以此來(lái)提高準(zhǔn)確率并縮小范圍。

1.3.2 miRNA 靶基因富集分析 我們將差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入在線網(wǎng)站DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)6.7，以FDR(<0.05作為入選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行基因本體(GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。對(duì)表達(dá)差異明顯的基因進(jìn)行功能注釋，分析這些基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程以及主要涉及的腫瘤相關(guān)通路。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用edgeR統(tǒng)計(jì)學(xué)方法篩選出DEGs，閾值設(shè)為FDR<0.05，|FC|>1。利用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，篩選與前列腺癌預(yù)后相關(guān)的miRNA。計(jì)量資料以χ2表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在前列腺癌組織、癌旁組織中共159個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中表達(dá)下調(diào)59個(gè)、表達(dá)上調(diào)100個(gè)。

Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，miR-17高表達(dá)的前列腺癌患者預(yù)后不良，前列腺癌患者miR-17表達(dá)的生存曲線(見(jiàn)圖1)。

圖1 前列腺癌組織miR-17表達(dá)的生存曲線

在52例配對(duì)前列腺癌及癌旁組織標(biāo)本miR-17相對(duì)表達(dá)量分別為3 852.66±1 800.41、1 581.22±391.71，二者比較，P<0.001)。Targetscan網(wǎng)站、miRDB網(wǎng)站、DIANA TOOL網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果取交集可以得到miR-17共138個(gè)靶基因。

主要參與轉(zhuǎn)錄DNA模版化、蛋白質(zhì)磷酸化、甲基胞嘧啶分解代謝、正調(diào)控凋亡過(guò)程、鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、胞質(zhì)分裂等生物學(xué)過(guò)程(見(jiàn)圖2A)；主要的分子功能包括它們與蛋白激酶結(jié)合、核酸結(jié)合、金屬離子結(jié)合、鈣離子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等(見(jiàn)圖2B)。與miR-17有關(guān)的信號(hào)通路有雌激素信號(hào)通路、cAMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑、趨化因子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路和癌癥蛋白聚糖信號(hào)通路等13條信號(hào)通路(見(jiàn)圖2C)。

注：圖A為miR-17靶基因參與的生物過(guò)程；圖B為miR-17靶基因的分子功能;圖C為miR-17靶基因參與的信號(hào)通路

圖2miR-17靶基因生物學(xué)功能及信號(hào)通路分析結(jié)果

3 討論

本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中52例癌旁組織和499例前列腺癌組織樣本共篩選出159個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中上調(diào)表達(dá)miRNA100個(gè)，下調(diào)表達(dá)miRNA59個(gè)。在100個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)miRNA中進(jìn)一步篩選出2個(gè)與預(yù)后相關(guān)，然后由P值和預(yù)后生存曲線共同確定選出其中最可成為潛在生物標(biāo)記物的miRNA-miR-17，并重點(diǎn)對(duì)miR-17進(jìn)行更深層次的研究，對(duì)miR-17在癌旁組織與前列腺癌組織中的差異表達(dá)進(jìn)行分析，然后利用三種常見(jiàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其靶基因，并對(duì)預(yù)測(cè)出的靶基因功能進(jìn)行GO富集與KEGG分析，富集結(jié)果顯示miR-17的下游靶基因與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，蛋白質(zhì)磷酸化，轉(zhuǎn)錄因子活性和細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)miR-17的進(jìn)一步研究，相信這將會(huì)為前列腺癌病人的早期診斷，有效治療及預(yù)后開辟一條新的道路。

miRNA是長(zhǎng)度為19～24個(gè)堿基的高度保守的單鏈非編碼RNA。在許多發(fā)育和生理過(guò)程中都很重要，其作用主要是通過(guò)它的種子序列與靶基因的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞分化，增殖，胚胎發(fā)育以及免疫反饋機(jī)制等生命活動(dòng)中起到重要作用[11～13]。而且，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中microRNA以促癌或抑癌基因角色參與其中[14, 15]，其表達(dá)異常影響細(xì)胞增殖，凋亡，侵襲和轉(zhuǎn)移等腫瘤不良形態(tài)，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miR-17在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不同的作用。miR-17可通過(guò)影響B(tài)RCA1的表達(dá)在家族性和彌散性乳腺癌中發(fā)揮作用[15]，在實(shí)體腫瘤細(xì)胞中通過(guò)靶向Mekk2恢復(fù)miR-17/20a的表達(dá)，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的抗腫瘤活性[16]。但是目前對(duì)于miR-17在前列腺癌中的表達(dá)及其作用還沒(méi)有明確深入的研究。近年來(lái)隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)于腫瘤的探索有了全面的應(yīng)用，比如基因芯片和后續(xù)的二代高通量測(cè)序等等都使得研究人員可以清楚的了解到基因?qū)用娴谋磉_(dá)數(shù)據(jù)及變化。miRNAs在包括前列腺癌在內(nèi)的眾多腫瘤中的表達(dá)與正常組織相比有明顯差異。以此我們可以篩選出前列腺癌[17]特異性以及靶向治療方面有關(guān)的新型腫瘤標(biāo)記物[18]從而做到早期診斷和靶向治療的目的。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法探討miR-17在前列腺癌中的表達(dá)及其靶基因的功能進(jìn)而影響前列腺癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，這是一種新興的手段來(lái)研究前列腺癌可能的發(fā)病機(jī)制及其潛在的預(yù)后標(biāo)記物，不僅豐富了我們對(duì)前列腺癌已知發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知，同時(shí)為今后對(duì)其發(fā)生發(fā)展的研究提供了可用的基礎(chǔ)。我們利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺癌的數(shù)據(jù)以此來(lái)收集與前列腺癌相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。將癌組織與非癌組織樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，篩選出與前列腺癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)的miRNA標(biāo)記物。因?yàn)閙iR-17在前列腺癌組織中異常高表達(dá)，而且在Kaplan-Meier預(yù)后生存曲線分析結(jié)果可見(jiàn)其高表達(dá)提示預(yù)后差。這些結(jié)果表明檢測(cè)前列腺癌組織中miR-17的表達(dá)具有非常重要的臨床意義。但是目前的大多數(shù)研究還局限于實(shí)驗(yàn)室層面，microRNA直接用于臨床的研究還需要進(jìn)一步確認(rèn)，發(fā)展。因此，我們要更加深入地對(duì)microRNA在前列腺癌的作用加以研究，以此為前列腺的臨床早期診斷以及治療提供幫助。

綜上所述，前列腺癌組織、癌旁組織共159個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中表達(dá)下調(diào)59個(gè)、表達(dá)上調(diào)100個(gè)。miR-17高表達(dá)的前列腺癌患者預(yù)后差。miR-17共138個(gè)靶基因，主要參與轉(zhuǎn)錄DNA模版化、蛋白質(zhì)磷酸化、甲基胞嘧啶分解代謝、正調(diào)控凋亡過(guò)程、鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、胞質(zhì)分裂等生物學(xué)過(guò)程；主要分子功能包括它們與蛋白激酶結(jié)合、核酸結(jié)合、金屬離子結(jié)合、鈣離子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等。與miR-17有關(guān)的信號(hào)通路有雌激素信號(hào)通路、cAMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑、趨化因子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路和癌癥蛋白聚糖信號(hào)通路等13條信號(hào)通路。miR-17可作為前列腺癌發(fā)生和預(yù)后評(píng)價(jià)的潛在生物標(biāo)記物。但miR-17與前列腺癌的相關(guān)性還需要大樣本的研究來(lái)證實(shí)與支持。