奶牛乳房炎主要致病原的分離鑒定及藥敏試驗

葛影影，張震，何國戈，鄭經成，胡克科

（1.廣東省清遠市農業科技推廣服務中心，清遠 511500；2.河南省奶牛生產性能測定中心，鄭州 450000 ）

乳房炎是奶牛的一種常見、高發、難防、高淘汰的疾病，全世界每年因乳房炎造成的損失高達350多億美元[1]，我國每年因奶牛隱性乳房炎造成的損失約1.35億元，平均每個病例損失1 200～3 600元[2]。據報道，引發奶牛乳房炎的主要致病菌有細菌、病毒、支原體和真菌等，約150多種[3]，但以細菌性感染為主。奶牛乳房炎的發生除病原菌感染因素外，與季節、氣候的變化、環境衛生狀況、飼養管理水平、擠奶設備消毒與監測、奶牛自身及遺傳等因素也密切相關。調查發現，近年來河南省奶牛乳房炎的發病率偏高(70.66%)，其中臨床型乳房炎的平均發病率約7.18%，隱性乳房炎的平均發病率約63.48%[4]。獸醫臨床上用抗生素治療病原菌性奶牛乳房炎雖取得一定效果，但因地區差異，引起乳房炎的病原菌種類不同，長期大量使用單一抗生素導致的病原菌產生耐藥性、乳汁獸藥和毒素殘留等問題突出，增加了乳房炎治療工作的難度[5]。本研究針對河南地區奶牛乳房炎主要致病菌進行了分離鑒定和臨床藥敏試驗，旨在為減少該地區乳房炎發病率，降低牧場養殖經濟損失，更好地保證乳品質量安全提供參考依據。

1 材料

1.1 采樣對象

選擇河南4個地區20家奶牛場，采集乳樣共210份。

1.2 主要試劑

MH肉湯、營養瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基，購自青島日水生物技術股有限公司；伊紅美藍瓊脂培養基、卻普曼瓊脂培養基、革蘭氏染液，購自青島高科園海博生物科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；乳房炎病原菌基因組 DNA 提取試劑盒和奶牛乳房炎病原體檢測試劑盒，購自北京博奧生物集團有限公司；加州隱性乳房炎診斷液，北京奶牛中心生產。

2 方法

2.1 乳樣采集

采樣前先用40℃左右的溫水清洗乳房，再用75%酒精棉球消毒，然后用一次性紙巾或消毒干毛巾將乳頭擦拭干凈，棄前三把奶后采集約20mL的奶樣，放入無防腐劑的無菌奶樣管，做好標記。

2.2 乳房炎的檢測

2.2.1 加州乳房炎檢測法（CMT）

每個檢測盤內加入2mL乳房炎檢測（CMT）試劑和2mL乳樣，傾斜45°緩慢晃動，使盤內的乳汁與檢測液充分混合。根據混合后乳汁狀態，結合試劑瓶上的說明書進行判定。CMT的判定標準見表1。2.2.2 奶牛生產性能測定（DHI）

表1 CMT法的判定標準

將奶樣送至實驗室，使用荷蘭Delta體細胞乳成分綜合分析儀測定體細胞和乳成分。通過檢測乳汁體細胞水平，并參考乳房炎SCC判定標準（≥50萬個/mL），輔助診斷奶牛是否感染乳房炎及乳房炎的發病程度。根據乳成分測定結果，輔助分析奶牛日糧營養水平是否合理。

2.3 主要病原菌的分離

對CMT檢測呈陽性的乳樣進行病原菌的分離鑒定，乳樣混勻后劃線接種于鮮血瓊脂培養基，37℃培養18～24h，挑取單菌落進行涂片、染色和鏡檢。根據菌落生長特征接種于麥康凱培養基、伊紅美藍培養基、改良愛德華培養基等選擇性培養基， 進一步純化培養后超低溫保存菌種。

2.4 恒溫擴增微流控芯片核酸分析法

2.4.1 奶牛乳房炎基因組 DNA 提取

無菌條件下吸取1mL牛奶到無菌離心管(正常和隱性乳房炎牛奶取1mL；臨床癥狀明顯的牛奶最多取200μL)，12 000r/min離心5min，棄上清液，加入1mL生理鹽水和 TE 溶液充分混勻，12 000r/min 離心2min，棄上清留沉淀，然后按照乳房炎基因組DNA提取試劑盒使用說明進行操作。

2.4.2 DNA 質量檢測

取5μL乳房炎核酸樣品置于微型分光光度計定量儀器中測定。若定量結果≥25ng/μL，則稀釋到20ng/μL后與反應液混合后上芯片檢測；若定量結果≤25ng/μ L，則直接與反應液混合后上芯片檢測。

2.4.3 恒溫擴增微流控芯片核酸分析檢測

根據芯片分析檢測說明制備核酸分析檢測擴增反應體系，放入恒溫擴增微流控芯片核酸分析儀進行核酸擴增分析檢測。

2.5 藥敏試驗

將分離純化的奶牛乳房炎主要致病菌接種于營養MH肉湯，恒溫汽浴培養18h，用無菌生理鹽水將菌液稀釋至濃度約為2×106cfu/mL，吸取菌液200μL，用無菌涂布棒均勻涂布于MH瓊脂平板上。將12種藥敏紙片分別輕貼于兩個平板上，37℃恒溫培養18～24h，根據抑菌圈的直徑大小判定分離株對藥物的敏感性。藥敏試驗判定標準：抑菌環直徑≥20mm為高度敏感；10mm≤抑菌環直徑＜20mm為中度敏感；抑菌環直徑＜10mm為耐藥。

3 結果與分析

3.1 奶牛乳房炎發病率檢測結果

檢測發現，奶牛乳房炎的總發病率為49.52%（104/210），其中臨床型乳房炎和隱性乳房炎的發病率分別為4.76%（10/210）、44.76%（94/210），兩者間發病率的比例接近5∶47。

3.2 乳房炎病原菌種類及比例

表2 乳房炎病原檢出種類及比例

從210份乳樣中共分離出287株乳房炎致病菌。其中，乳房鏈球菌、牛棒狀桿菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌、牛支原體分別檢出118株、75株、34株、16株、17株，各占檢出比例的41.11%、26.13%、11.85%、5.57%、5.92%（表2）。

3.3 主要致病菌藥敏試驗結果

選取臨床上常用的11種抗菌藥物對奶牛乳房炎4種主要致病菌進行藥敏試驗。結果顯示，乳房鏈球菌、無乳鏈球菌、牛棒狀桿菌、大腸桿菌對環丙沙星、恩諾沙星（喹諾酮類）高度敏感，對四環素、氯霉素中度敏感；對復方新諾明、頭孢噻肟、頭孢喹啉中高度敏感；對青霉素耐藥（表3）。

表3 主要致病菌藥敏試驗結果

4 討論

本試驗通過恒溫擴增芯片法檢測210份陽性乳樣，共檢出11種287株病原菌，球菌、桿菌以及支原體均被檢出，可見，細菌感染性乳房炎為常見多發。其中，鏈球菌、牛棒狀桿菌、大腸桿菌、牛支原體所占比率高達90.58% 。以上被檢出病原菌是引起河南地區奶牛乳房炎的主要致病菌。這與周婷婷等[6]的報道不完全一致。金黃色葡萄球菌檢出率明顯下降，可能是由于牧場對奶牛乳房和體軀的清洗、刷拭次數增加使皮膚保持干凈完整，擠奶工做好清潔操作和定期消毒工作，金黃色葡萄球菌不易通過損傷的皮膚侵染、定植。桿菌感染性乳房炎的發病率也較高，這與王建忠的報道基本一致[7]。大腸桿菌、牛棒狀桿菌、乳房鏈球菌均屬于環境性病原菌，主要是因畜舍內外及奶廳的環境衛生不良引起，如糞便污水、墊料土壤、污染的奶杯內襯、骯臟的乳房乳頭表面均是環境性病原菌的生活場所。因此，乳房炎防控工作中應加強擠奶設備的消毒和監測、規范擠奶員工的標準化操作程序、及時清理糞污、定期更換墊料和消毒圈舍，以有效阻斷傳播途徑。其中，牛棒狀桿菌主要感染成年母牛，寄居在泌乳、干奶和妊娠階段奶牛乳腺內的時間較長，嚴重危害奶牛的產奶性能和乳品質。目前，關于牛棒狀桿菌引發奶牛乳房炎的報道相對較少，其臨床診斷和防治尚需進一步探究。本試驗檢出了牛支原體性乳房炎。奶牛的擠奶、呼吸、輸精和分娩過程是傳播支原體的重要途徑[8]，感染支原體的奶牛乳區表現紅腫、脹痛，產奶量顯著下降，乳汁呈黃褐色膿汁狀，甚至停止產乳；有時會伴隨關節腫痛、肢蹄跛行、呼吸異常等癥狀，在奶牛生產中應予以高度重視。

奶牛乳房炎的治療主要以抗生素為主。通過試驗結果發現，河南地區治療奶牛乳房炎選擇的有效藥物有環丙沙星、恩諾沙星、復方新諾明、頭孢噻肟、頭孢喹啉等，原因是環丙沙星等作為喹諾酮類藥物的新一代產品，抗菌廣泛性好，抑制多種病原菌作用明顯[9]，這與韓瑞霞的研究報道相近[10]。可見，喹諾酮類和頭孢菌素類抗菌藥物對河南地區幾種主要致病菌引起的奶牛乳房炎具有良好抑制作用。但以上四種主要致病菌對青霉素均產生耐藥性，可能是生產中長期大量選擇使用價格低的青霉素導致耐藥菌株大量出現，菌株體內出現耐藥基因，增加了抗性。因此，奶牛生產中開展及時、準確、有效的乳房炎主要病原菌的診斷與藥敏試驗及相關耐藥基因的篩查工作，制定合理的交替用藥綜合防控方案，對縮短乳房炎治療時間、降低治療成本、減少經濟損失有著重要意義。