Xpert MTB/RIF Ultra診斷結(jié)核性腦膜炎的價(jià)值

張培澤 鄭俊峰 付亮 李天品 袁星燎 劉厚明 鄧國防

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是由結(jié)核分枝桿菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，臨床上由于早期快速診斷存在困難，常常導(dǎo)致治療延誤，進(jìn)而導(dǎo)致較高的致殘率及致死率。2013年開始，WHO推薦Xpert MTB/RIF(Cepheid公司,美國；簡稱“Xpert”)用于兒童及成人肺內(nèi)外結(jié)核病的初始快速診斷[1]。Xpert MTB/RIF Ultra(簡稱“Xpert Ultra”)是在GeneXpert平臺(tái)上開發(fā)的新的全自動(dòng)巢式實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，非劣性試驗(yàn)證實(shí)其在診斷結(jié)核方面具有良好的敏感度和特異度[2]，但該技術(shù)在國內(nèi)結(jié)核病患者中的應(yīng)用未見報(bào)道。本試驗(yàn)采用前瞻性的研究方法，對(duì)臨床疑似結(jié)核性腦膜炎患者的腦脊液進(jìn)行檢測(cè)，比較Xpert Ultra、Xpert及液體培養(yǎng)法3種檢測(cè)技術(shù)的敏感度和特異度，探討Xpert Ultra在早期診斷結(jié)核性腦膜炎中的應(yīng)用價(jià)值。

資料和方法

一、 研究對(duì)象

選取深圳市第三人民醫(yī)院2018年2月1日至12月31日臨床疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核感染的非HIV感染患者21例。對(duì)所有患者的腦脊液進(jìn)行常規(guī)、生化、腺苷脫氨酶(ADA)檢查，并采用Xpert Ultra、Xpert及液體培養(yǎng)法對(duì)患者的腦脊液進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)。

本研究方案獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

二、試驗(yàn)方法

1．標(biāo)本的收集和制備：收集每例患者腦脊液4～6 ml，1～2 ml用于Xpert Ultra檢測(cè)， 1～2 ml用于Xpert檢測(cè)，1～2 ml用于分枝桿菌液體培養(yǎng)，所有標(biāo)本均未使用離心富集法。

2．儀器與試劑: Xpert檢測(cè)系統(tǒng)購自美國Cepheid公司，Xpert試劑盒及標(biāo)本處理液購自美國Cepheid公司； Xpert Ultra試劑盒由美國Cepheid公司贈(zèng)送用于臨床科研。BACTEC MGIT960系統(tǒng)及其配套試劑(MGIT生長指示管，分枝桿菌培養(yǎng)添加劑試劑盒，分枝桿菌聯(lián)合藥敏試劑盒)購自美國BD公司。

3．腦脊液Xpert Ultra檢測(cè):取1～2 ml腦脊液，按照說明書操作指南加入標(biāo)本處理液后放入儀器中進(jìn)行核酸擴(kuò)增，70 min儀器會(huì)自動(dòng)輸出檢測(cè)結(jié)果，即菌量及是否對(duì)利福平耐藥。當(dāng)插入序列IS6110 和IS1081基因片段特異性探針為陽性時(shí)即為檢測(cè)到MTB。利福平耐藥狀態(tài)根據(jù)rpoB基因4條特異性探針的熔解溫度來判斷。將rpoB特異性探針的熔解溫度與系統(tǒng)預(yù)設(shè)的野生型菌株的熔解溫度進(jìn)行對(duì)比，如一致，即為利福平敏感；否則，提示利福平耐藥。

4．腦脊液Xpert檢測(cè)：取1～2 ml腦脊液，按照說明書操作指南加入標(biāo)本處理液后放入儀器中進(jìn)行核酸擴(kuò)增，2 h內(nèi)儀器會(huì)自動(dòng)輸出檢測(cè)結(jié)果，即菌量及是否對(duì)利福平耐藥，當(dāng)6條探針中除了質(zhì)控探針(SPC)外至少2條特異性探針為陽性時(shí)，提示MTB感染。對(duì)利福平耐藥性的判斷基于MTB特異性探針的Δ循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)(即最大Ct值與最小Ct值之差)。當(dāng)ΔCt>3.5時(shí)，提示利福平耐藥；當(dāng)ΔCt≤3.5則提示利福平敏感。

5.液體培養(yǎng)法：采用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行液體培養(yǎng)，參照美國BD醫(yī)療器械(上海)有限公司提供的《MGIT液體培養(yǎng)操作手冊(cè)》進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作。 取處理好的腦脊液標(biāo)本1～2 ml加入液體培養(yǎng)管中，并放入BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)一步行藥敏試驗(yàn)。

6.實(shí)驗(yàn)分組：所有患者按照入組時(shí)間進(jìn)行排序。參照2010年國際TBM協(xié)作組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，以臨床評(píng)分≥6分作為參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行分組：(1)結(jié)核性腦膜炎組：符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)臨床評(píng)分≥6分；共15例；其中確診組5例：即符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)腦脊液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性；很可能組8例：即符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)臨床評(píng)分≥10分(無神經(jīng)影像學(xué)表現(xiàn))或臨床評(píng)分≥12分(伴神經(jīng)影像學(xué)表現(xiàn))，同時(shí)排除其他類型腦膜炎；可能診斷組2例：即臨床評(píng)分6～9分(無伴神經(jīng)影像學(xué)表現(xiàn))；(2)非結(jié)核性腦膜炎組：不符合結(jié)核性腦膜炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，未進(jìn)行抗結(jié)核治療，排除TBM，共6例。所有患者在進(jìn)行結(jié)核檢測(cè)的同時(shí)留取腦脊液進(jìn)行常規(guī)、生化檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同檢測(cè)方法之間的敏感度比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同檢測(cè)方法之間的一致性采用Kappa值表示，Kappa值落于0.0～0.20則一致性極低、0.21～0.40為一般、0.41～0.60 為中等、0.61～0.80為高度一致、0.81～1.00為幾乎完全一致。敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%； 特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。

結(jié) 果

一、各方法的檢測(cè)結(jié)果

1. 15例結(jié)核性腦膜炎患者中，10例患者腦脊液Xpert Ultra檢測(cè)陽性，陽性率66.7%。1例檢測(cè)值為“低(low)”，7例檢測(cè)值為“極低(very low)”，2例檢測(cè)值為“微量(trace call)”。4例患者腦脊液Xpert檢測(cè)陽性，陽性率26.7%。4例患者腦脊液培養(yǎng)陽性，陽性率26.7%。在單純Xpert Ultra陽性的5例患者中，例2為抗結(jié)核藥物治療10 d后采集的腦脊液，該患者在治療前腦脊液Xpert檢測(cè)及分枝桿菌培養(yǎng)均為陽性；例12的患者留取腦脊液同時(shí)進(jìn)行了二代測(cè)序，提示檢出結(jié)核分枝桿菌DNA；3例患者(例5、例9、例21)均為全身多系統(tǒng)結(jié)核病患者，未行腦脊液其他結(jié)核分子生物學(xué)診斷。10例腦脊液Xpert Ultra檢測(cè)陽性的患者中有3例未能判斷利福平的耐藥性，其中例21患者Xpert Ultra 檢測(cè)值為“極低”，例6和8患者檢測(cè)值為“微量”；其他7例患者未發(fā)現(xiàn)對(duì)利福平耐藥，與臨床其他標(biāo)本(痰液、關(guān)節(jié)液)結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致(表1)。

2. 6例非結(jié)核性腦膜炎患者中，排除腦膜炎者4例(1例肝性腦病，1例神經(jīng)性頭痛，2例代謝性腦病)，病毒性腦膜炎1例，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤1例。所有患者的腦脊液進(jìn)行Xpert Ultra檢測(cè)、Xpert檢測(cè)、液體培養(yǎng)的結(jié)果均為陰性。

二、各檢測(cè)方法的診斷效能

Xpert Ultra檢測(cè)用于腦脊液診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度為66.7%，特異度為100.0%，陽性預(yù)測(cè)值為100.0%，陰性預(yù)測(cè)值為54.5%。Xpert與培養(yǎng)法結(jié)果一致，用于腦脊液診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度為26.7%，特異度為100.0%，陽性預(yù)測(cè)值為100.0%，陰性預(yù)測(cè)值為35.3%；3種檢測(cè)方法在診斷敏感度上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.821,P=0.028)(表2)。

表1 15例結(jié)核性腦膜炎患者臨床資料和腦脊液實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表1

表2 不同檢測(cè)方法以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)結(jié)核性腦膜炎的診斷效能

注3種檢測(cè)方法檢測(cè)的標(biāo)本為腦脊液；敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%； 特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

三、對(duì)3種檢測(cè)方法的一致性評(píng)價(jià)

15例結(jié)核性腦膜炎患者中，2例3種檢測(cè)方法均陽性，4例Xpert Ultra檢測(cè)、Xpert檢測(cè)陽性，3例患者Xpert Ultra、液體培養(yǎng)陽性(圖1)。

討 論

結(jié)核性腦膜炎是嚴(yán)重威脅人類生命的結(jié)核病，結(jié)核性腦膜炎快速、準(zhǔn)確的診斷及制定合理的治療方案是決定預(yù)后的關(guān)鍵因素[4]。傳統(tǒng)腦脊液的細(xì)胞學(xué)檢查、生化檢查、抗酸染色涂片檢查、分枝桿菌培養(yǎng)因敏感度低或耗時(shí)過長等原因難以滿足臨床需要，尋找早期快速準(zhǔn)確的診斷方法一直是臨床上亟待解決的問題。

一、Xpert Ultra檢測(cè)技術(shù)在診斷結(jié)核性腦膜炎中的敏感度問題

近年來研發(fā)的Xpert檢測(cè)技術(shù)以rpoB基因?yàn)榘谢颍瑢?shí)現(xiàn)MTB的分子生物學(xué)快速檢測(cè)及利福平耐藥性評(píng)價(jià)，該技術(shù)檢測(cè)腦脊液診斷TBM的敏感度為23%～41%[5-6]，使用6 ml以上的腦脊液離心濃集后再進(jìn)行檢測(cè)能進(jìn)一步提高敏感度[7]，但臨床上往往難以一次性獲得大量腦脊液用于檢測(cè)，因此其診斷效能仍難以滿足臨床需求[8]。新一代Xpert Ultra以rpoB和多拷貝的插入序列IS1081、IS6110基因片段為靶基因，使用較Xpert更大的PCR反應(yīng)管(在Xpert Ultra中為50 μl PCR反應(yīng)體系，而在Xpert中為25 μl)，全巢式PCR技術(shù)聯(lián)合高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)分析技術(shù)，與Xpert的114 菌落形成單位(CFU)/ml的檢測(cè)限(limit of detection, LOD)比較，Xpert Ultra的LOD為16 CFU/ml[9]，檢測(cè)位點(diǎn)增加及檢測(cè)方法的改進(jìn)使敏感度進(jìn)一步提高,特別是對(duì)于含菌量較少的標(biāo)本，其檢測(cè)效能將進(jìn)一步提升[10-13]。Xpert Ultra的檢測(cè)結(jié)果在原來Xpert的“高、中、低、極低”4個(gè)級(jí)別的基礎(chǔ)上增加了“微量”，共5個(gè)級(jí)別。Bahr等[14]報(bào)告129例HIV感染患者取腦脊液3～15 ml進(jìn)行離心濃集后分別采用與本研究一致的Xpert Ultra、Xpert、液體培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)，在臨床判斷為“確定”及“很可能”的23例結(jié)核性腦膜炎患者中，16例患者Xpert Ultra檢測(cè)陽性，敏感度為70.0%；而Xpert及液體培養(yǎng)法的敏感度為43%，提示Xpert Ultra具有更高的敏感度。筆者使用1～2 ml非離心濃集的腦脊液進(jìn)行檢測(cè)，15例患者中有10例Xpert Ultra陽性，敏感度為66.7%，高于Xpert及培養(yǎng)法26.7%。這一敏感度與Bahr等[14]使用離心濃集后的腦脊液標(biāo)本的報(bào)告結(jié)果相似，提示1～2 ml的腦脊液用于Xpert Ultra檢測(cè)仍具有良好的敏感度。為了驗(yàn)證Xpert Ultra的特異度，筆者分析5例單純Xpert Ultra檢測(cè)陽性的患者，其中例2為抗結(jié)核藥物治療2周后的標(biāo)本，該患者在用抗結(jié)核藥物治療前腦脊液Xpert及培養(yǎng)均為陽性，結(jié)核性腦膜炎診斷明確，而用藥2周后僅Xpert Ultra 檢測(cè)為陽性，Xpert及培養(yǎng)均為陰性；例12在進(jìn)行Xpert Ultra檢測(cè)的同時(shí)，進(jìn)行二代測(cè)序也提示檢出了結(jié)核分枝桿菌，病原學(xué)診斷結(jié)核性腦膜炎成立。例5、例9、例21屬多系統(tǒng)結(jié)核病患者，痰液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)均為陽性，但因其他原因未能提供足夠的腦脊液標(biāo)本行進(jìn)一步分子生物病原學(xué)檢查，參照目前國外應(yīng)用Xpert Ultra檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)，在HIV感染者、兒童、肺外結(jié)核標(biāo)本，檢測(cè)結(jié)果為陽性甚至是“極低值”被認(rèn)為是真陽性的結(jié)果，用于臨床決策及患者的隨訪治療[2]。因此，筆者認(rèn)為這3例患者病原學(xué)確診結(jié)核性腦膜炎成立。但由于本研究樣本量少，對(duì)于3種方法檢測(cè)TBM的敏感度及特異度在判定時(shí)可能仍存在一定的偏差，未來需要進(jìn)一步增加樣本量達(dá)到更精確的判斷。

二、Xpert Ultra檢測(cè)技術(shù)在診斷結(jié)核性腦膜炎利福平耐藥性中的的問題

Xpert Ultra檢測(cè)技術(shù)采用熔解曲線而不是實(shí)時(shí)熒光PCR的方法提高了利福平耐藥性檢測(cè)的準(zhǔn)確性。Xpert Ultra檢測(cè)技術(shù)使用4條rpoB基因探針檢測(cè)利福平耐藥突變，當(dāng)目標(biāo)基因片段上發(fā)生突變時(shí)會(huì)改變其熔解溫度，將4條探針的熔解溫度與系統(tǒng)內(nèi)野生型參考值對(duì)比，從而判斷樣本的利福平耐藥性狀態(tài)。 與Xpert檢測(cè)相比，該方法理論上可以更好地區(qū)分沉默突變和導(dǎo)致耐藥的突變[9,13,15-16]；但當(dāng)檢測(cè)值為“微量”時(shí)，利福平的耐藥性無法判斷。本研究中，例6、例8的Xpert Ultra檢測(cè)值為“微量”，無法進(jìn)行耐藥性判定；例21的Xpert Ultra檢測(cè)值為“極低”，同樣無法進(jìn)行利福平耐藥性判斷；這與Xpert Ultra的耐藥檢測(cè)方法相關(guān)[9]，當(dāng)Xpert Ultra檢測(cè)到極少量TB-DNA時(shí)，可能出現(xiàn)利福平耐藥性檢測(cè)困難的問題。綜合分析7例檢測(cè)值為“極低”的標(biāo)本中，僅1例(例21)利福平耐藥性無法判斷，其他6例患者均明確提示未檢測(cè)到利福平耐藥位點(diǎn)，與其他部位(如痰、關(guān)節(jié)液)的標(biāo)本耐藥性檢測(cè)結(jié)果基本一致，提示其在檢測(cè)值為“極低”時(shí)仍具有良好的利福平耐藥性判斷。同樣，由于本研究樣本量少，尚未能就Xpert Ultra在檢測(cè)值為“極低”時(shí)的利福平耐藥性做出明確評(píng)價(jià)。

因此，基于筆者的初步探索發(fā)現(xiàn)，Xpert Ultra在結(jié)核性腦膜炎的診斷中具有良好的特異度和優(yōu)于Xpert 的敏感度。筆者認(rèn)為將Xpert Ultra用于可疑結(jié)核性腦膜炎的早期診斷，將有助于臨床進(jìn)行精準(zhǔn)的病原學(xué)診斷；當(dāng)檢測(cè)到極低及微量的TB-DNA時(shí)，存在利福平耐藥性判斷困難的問題，需要臨床進(jìn)一步對(duì)利福平的耐藥性進(jìn)行驗(yàn)證。