發光二極管熒光顯微鏡在基層實驗室檢測分枝桿菌的價值

張學志 林百豐 裴新發 陳麗 彭英 唐鷺

萋爾-尼爾遜染色(簡稱“萋-尼染色”)為涂片染色鏡檢的標準方法，此方法因其快速、易操作、價格低廉、特異度高等優點成為結核病實驗室廣泛使用的主要診斷技術之一。但該方法敏感度較低，并且閱片時間較長，容易對患者造成漏診。研究發現，熒光染色法較該方法的敏感度提高了約8%[1]，而特異度與其相當，鏡檢時間明顯縮短，特別適用于標本量較大的基層結核病實驗室。熒光染色法的主要缺點是傳統熒光顯微鏡價格昂貴，需要暗室進行檢測，影響其廣泛應用。近年來，新的光源發光二極管(LED)應用于熒光顯微鏡上很好地解決了普通熒光顯微鏡的這些缺點。為探索在基層實驗室推廣使用此項技術的前景，筆者選擇8個縣級結核病防治機構(簡稱“結防機構”)對此項技術的應用進行了多中心評估，現報告如下。

資料和方法

1.研究對象：連續納入2017年7月至2018年10月黑龍江省阿城、尚志、驗收、賓縣、杜蒙、林甸、泰來、甘南8個縣級結防機構的初診肺結核可疑癥狀者，共3770例，每例患者留取2～3份痰標本，共9079份，全部進行痰結核分枝桿菌固體培養。

2.試劑和儀器：各縣級結防機構使用的熒光染色液、萋-尼染色液和酸性羅氏培養基均購自珠海貝索生物技術有限公司；LED熒光顯微鏡為寧波舜宇儀器有限公司生產的EX30型。

3.試驗方法：(1)痰涂片鏡檢：每份痰標本涂2張痰涂片，分別用萋-尼染色法和熒光染色法進行染色，操作方法參見文獻[2]，同時進行檢測并將檢測結果進行登記，并記錄鏡檢所用時間。由省級結核病預防控制中心每月抽取陽性涂片進行復核。(2)培養：對納入的痰標本全部進行分枝桿菌簡單法固體分離培養，操作方法參見文獻[3]。(3)痰涂片保存：熒光染色涂片和萋-尼染色涂片正常保存在室溫條件下，避免陽光直射。(4)質量控制：為保證鏡檢的質量，在正式啟動前對8個縣區的實驗室人員進行嚴格培訓，使其能夠準確報告結果，培訓結束后試運行1個月，并對實驗室人員進行室間質量評價和室內質量控制，全部達標后才正式開始試驗。

結 果

1.初診患者陽性檢出情況：萋-尼染色法和熒光染色法涂片鏡檢陽性率分別為11.41%(430/3770)和12.79%(482/3770)，固體培養陽性率為17.14%(646/3770)，三種方法檢測陽性率比較差異有統計學意義(χ2=5602.10，P<0.01)。

2.兩種染色方法的診斷價值評價：以痰培養結果為參照標準，萋-尼染色法和熒光染色法涂片鏡檢分枝桿菌的敏感度分別為61.46%和66.72%，特異度分別為 98.94%和98.37%。 萋-尼染色法約登指數為0.604，熒光染色法約登指數為0.651，見表1。

3.讀片時間比較：兩種不同的染色方法鏡檢每份痰涂片所用的時間不同，LED熒光顯微鏡鏡檢所用的時間明顯低于普通光學顯微鏡鏡檢所用時間，差異有統計學意義(F=5670.80，P<0.01)，見表2。

4. 熒光染色陽性涂片常溫避光保存情況：將LED熒光顯微鏡檢測的1179張陽性級別不同的熒光染色涂片放入不透光的玻片盒內常溫(22～25 ℃)存放，并避免陽光直射，進行4個月的連續觀察，其中1～9條/50個視野涂片82張，+級328張，++級202張，+++級282張，++++級285張。第1～4個月出現定性錯誤[2]的依次為5張(0.42%；均為幾條菌)、13張(1.10%；均為幾條菌)、21張(1.78%；20張為幾條菌，1張為+級)、27張(2.29%；25張為幾條菌，2張為++級)。第1～4個月出現定量誤差[2]的依次為10張(0.85%)、33張(2.80%)、65張(5.51%)、72張(6.11%)。

表1 萋-尼染色法和熒光染色法以痰培養結果為參照標準的檢測效能

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；一致率=(真陽性例數+真陰性例數)/總例數×100%

表2 不同級別鏡檢結果應用兩種染色方法顯微鏡檢查讀片時間的比較

注萋-尼染色顯微鏡檢查結果分級標準：陰性：連續觀察300個不同視野，未發現抗酸桿菌；條數：1～9條/300個視野；+：3～9條/100個視野，連續觀察300個視野；++：1～9條/10個視野，連續觀察100個視野；+++：1～9條/1個視野；++++：≥10條/1個視野。熒光染色LED顯微鏡檢查結果分級報告標準：陰性：0條/50個視野；條數：1～9條/50個視野；+：10～49條/50個視野；++：1～9條/1個視野；+++：10～99條/1個視野；++++：100條及以上/1個視野

討 論

本研究在黑龍江省8個縣區級結防機構進行了熒光染色液LED熒光顯微鏡和萋-尼染色液普通光學顯微鏡鏡檢痰涂片效果的比較。結果顯示，LED熒光顯微鏡鏡檢陽性率高于普通光學顯微鏡鏡檢，與丁北川等[5]的研究結果一致。同時，其他研究也顯示LED熒光顯微鏡鏡檢陽性率較普通光學顯微鏡增加9%[1,7-11]。

兩種鏡檢方法分別以痰培養結果為參照標準， LED熒光顯微鏡鏡檢敏感度為66.72%，普通光學顯微鏡鏡檢的敏感度為61.46%，與尚美等[6]報道結果一致；兩種方法的特異度相當。而文獻也曾報導LED熒光顯微鏡比普通光學顯微鏡鏡檢的敏感度有一定的提高，特異度基本無變化[1]。宋媛媛等[4]也報道LED熒光顯微鏡比普通光學顯微鏡鏡檢的敏感度有一定的提高。LED熒光顯微鏡鏡檢與痰培養的一致率為92.94%，大于普通光學顯微鏡鏡檢一致率，表明LED熒光顯微鏡鏡檢與固體培養法檢測效能更接近。

對LED熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡鏡檢不同級別陽性痰涂片和陰性痰涂片的讀片時間進行分析發現，兩種方法的鏡檢時間差異有統計學意義，前者比后者總體鏡檢時間縮短。這與宋媛媛等[4]報道的結果一致。

對所有熒光染色陽性痰涂片進行連續4個月的常溫避光保存觀察，發現隨著時間的推移有部分陽性涂片出現褪色的情況，出現褪色的有27張，但1～9條/50個視野痰涂片褪色的有25張，+級痰涂片褪色的有2張，對++～++++陽性級別的痰涂片幾乎無影響。熒光隨著時間的推移會出現淬滅現象，可能由于不同的菌體對熒光淬滅的快慢不同造成。痰涂片內含菌量越少淬滅的速度越快。由于只是部分陽性級別低的涂片會出現熒光消失，這對使用LED熒光顯微鏡進行常規的實驗室工作和痰涂片保存及質量控制影響并不大。

經過本次研究可以發現，LED熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡鏡檢相比敏感度有一定提高，特異度相當；同時，LED熒光顯微鏡鏡檢可以提高痰涂片檢測的陽性率，并大幅度降低了閱片時間，減輕實驗室人員的工作量。但值得注意的是，沒有閱讀熒光顯微鏡經驗的人員最好經過系統性的培訓，并在有經驗人員的協助下進行閱片。在痰涂片質量保證方面，由于北方溫度和濕度沒有南方高，只要避免陽光直射，直接將痰涂片放在不透明的玻片盒內室溫保存，在進行盲法質量控制檢查出現定性錯誤時對錯誤的痰涂片進行重新脫色復染即可。

綜上，LED熒光顯微鏡鏡檢不僅可提高檢測速度、檢測陽性率、對實驗室人員的要求不高、操作簡單，且儀器設備價格較為低廉，適合在基層實驗室進行推廣。