基因突變檢測及二代測序在急性髓系白血病預后分析中的應用

李世青 王剛

【摘 要】

影響急性髓系白血病（Acute Myelocytic Leukemia，AML）預后的主要因素包括細胞遺傳學、分子生物學等，同時近年來二代基因測序技術快速發展并逐漸應用于AML診斷及預后分析，因此本文介紹了二代測序的發展歷程以及從單基因檢測、雙或多基因聯合檢測兩方面對AML預后分析進行綜述。

【關鍵詞】急性髓系白血病；基因突變；預后；二代測序

【中圖分類號】 R365

【文獻標識碼】 A

【文章編號】 1672-3783（2019）02-03-001-01

急性髓系白血病（Acute Myelocytic Leukemia，AML）是一類髓細胞系起源的白血病細胞在血液、骨髓和其他組織中克隆性增殖的白血病。由于染色體異常以及基因突變等分子遺傳學或表觀遺傳學的異常，導致正常的造血系統在定向髓系分化的過程中，在不同階段發生惡變而引發血細胞分化的阻滯，形成不同亞型的血液系統疾病。對AML預后的分析，主要集中在細胞遺傳學染色體核型分析以及分子生物學基因檢測。運用二代測序能夠很好地分析具有預后意義的基因突變，為預后分層系統及個體化治療奠定一定的基礎。

1 AML預后影響因素

影響AML預后的因素主要有年齡、性別、初診時白細胞計數、白細胞分化階段以及有無先前的血液學疾病等一般情況，以及細胞遺傳學、分子學異常。而近年來發現，通過染色體核型評估預后滿足不了臨床需要。分子學異常研究是指基因突變分析，主要包括FLT3、NPM1、NMT3A、C-KIT、CEBPA、IDH1/2等AML患者中出現頻率較高的體細胞突變[1]。同時單基因突變分析仍不足以將占比60%以上的中危核型AML（Intermediate-risk AML，IR-AML）很好地進行預后分層，需納入新的基因及多基因突變組合來進一步分層。

2 二代測序技術

人類在2004年使用Sanger一代測序技術，完成了人類基因組的測序計劃，雖然該結果具有劃時代意義，但耗時和高成本限制了其廣泛的應用。由于一代測序的相對不足以及臨床及科研需要，二代測序技術應運而生。新一代測序技術（Next generation sequencing， NGS）具有高通量性、快速性、準確性、費用低和信息量豐富等優點，研究者可以在短時間內對基因進行精確定位和分析。目前二代測序的主要技術平臺代表有羅氏公司（Roche）的454測序儀（Roch GS FLX sequencer），Illumina公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD測序儀（ABI SOLiD sequencer）。同時二代測序技術包括全基因組測序、外顯子測序及轉錄組測序等。二代外顯子測序主要用于AML的預后分析，根據現有的基因雜交芯片，高效且敏感檢測多個基因突變，從而明確診斷和評估AML的預后，指導AML治療。

3 單基因突變分析與預后

3.1 FLT3基因突變與預后

FLT3突變發生于近30%的AML，在AML中有兩種常見形式：一種是內部串聯重復突變（FLT3-internal tandem duplication，FLT3-ITD），是正常核型AML（Cytogenetically Normal AML， CN-AML）中最常見的一種突變類型；另一種是累及激酶區活化環內的點突變 （FLT3 tryrosine kinase domain mutation，FLT3-TKD），其最常見于835位天冬氨酸及836位異亮氨酸的突變。除了研究突變存在與否，馬亮等應用Illumina的Miseq二代測序儀對23例FLT3-ITD陽性AML患者FLT3基因序列進行分析，共檢測到的33條ITD中，17條ITD插入序列為FLT3野生型完全重復，16條ITD為野生型部分重復，指出FLT3-ITD序列特征變化較大但突變熱點區域較為集中于p.Y572位至p.L602位之間[2]。FLT3-TKD突變在AML中發生率為5%～14%。目前FLT3-TKD突變對預后的影響尚無一致定論。

3.2 NPM1基因突變與預后

NPM1基因定位于染色體5q35，編碼核磷蛋白NPM主要定位于核仁區，野生型NPM主要對核糖體RNA進行加工、控制中心體的復制、維持基因組的穩定。NPM1基因突變后，NPM蛋白C端的氨基酸序列發生改變，NPM就會在細胞質中異常堆積。NPM1突變細胞往往表現為CD34和CD133缺失或低表達，而CD33分子高表達[3]。

3.3 DNMT3A基因突變與預后

DNMT（DNA甲基化轉移酶）是基因DNA甲基化的關鍵酶，主要類型有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。近年研究發現，DNMT3A與AML密切相關。DNMT3A基因突變存在于14%～36%的AML患者，在FAB分型M4、M5型患者中突變率更高，并與高齡、高白細胞計數、高血小板計數呈正相關。其突變類型R882的錯義突變最為常見，常見突變有R882H、R882C等。Ley TJ等的研究表明，存在DNMT3A突變的患者較不存在DNMT3A突變的患者有較短的總體生存率（OS）[4]。Marcucci等的研究結論進一步指出，在CN-AML患者中，年輕（< 60歲）的非R882位點突變患者無病生存期（DFS）、OS縮短，而老年（≥ 60歲）患者存在R882位點突變時才有相同的結果[5]。

3.4 C-KIT基因突變與預后

C-KIT（CD117）是一種原癌基因，位于人染色體4q12-13，是酪氨酸激酶受體蛋白家族的重要成員之一，C-KIT基因突變與急性白血病中的發病、治療和預后等密切相關。丁子軒等用基因測序方法對656例中國AML患者中C-KIT、NPM1、FLT3基因進行檢測并進行分析，發現t（8；21）/M2患者常伴有C-KIT的17號外顯子突變；inv（16）/M4患者常伴有C-KIT的8號外顯子突變[6]。

3.5 IDH基因突變與預后

IDH屬于DNA甲基化修飾基因，包括IDH1和IDH2兩種基因，分別位于2號和15號染色體。

IDH1突變率為4 %～14%，很少出現IDH1與IDH2共表達，突變類型多為R132位點突變。

IDH2突變率在AML患者中為3 %～19%，常與高齡、高中危血小板計數相關，其突變位點多在R140，其次是R172，易發生在AML-M5患者中，易表達CD34和CD13。R140突變的年輕AML患者預后良好，OS延長[7]。IDH1和IDH2突變對AML預后的意義還需進一步的研究證實。

4 多基因突變檢測與預后

4.1 FLT3-ITD突變與NPM1突變、DNMT3A突變

FLT3-ITD突變與NPM1突變密切相關，NPM1突變陽性的AML患者 FLT3-ITD的突變檢出率遠高于NPM1突變陰性的AML，而伴FLT3-ITD突變 AML M3患者中NPM1突變的檢出率亦高達60%。FLT3-ITD（-）/NPM1（+）的AML患者對誘導化療反應最好，完全緩解率（CR）最高，若存在FLT3-ITD突變，無論NPM1是否突變，AML患者的CR都會降低。

研究發現，FLT3-ITD、NPM1和DNMT3A突變往往共存發生，因此其預后意義也需要聯合進行分析。Hou HA等對506個AML患者的研究發現，DNMT3A的不良預后意義僅在伴NPM1（+）/FLT3-ITD（+）或NPM1（-）/FLT3-ITD（+）或NPM1（-）/FLT3-ITD（-）的情況下才能凸顯出來，而在伴發有利基因型 NPM1（+）/FLT3-ITD（-）時則顯示不出其不良預后[8]。國內有研究指出，對95例中危AML患者進行常見基因突變分析，發現5例患者同時出現FLT3-ITD、NPM1和DNMT3A基因突變，分析指出5例患者化療后均未緩解，并均在6個月內死亡[9]。

4.2 NPM1和IDH1/2同時突變伴FLT3-ITD陰性

IDH1突變很少與FLT3-ITD共表達，但出現FLT3-ITD突變時，累積復發率降低，為預后良好因素，而ITD陰性患者則相反，不過這限制在年輕的AML（非M3）患者中。對于年輕AML（非M3）患者，當FLT3-ITD（-）/NPM1（+）時，IDH2 R140突變患者的復發率比細胞遺傳學低危組低；而伴NPM1陰性時，IDH2 R172突變患者復發率與高危組相似[10]。

4.3 CEBPA雙突變/CEBPA單突變與其他基因突變

研究指出，CEBPA單突變相對CEBPA雙突變來說，更易伴發基因突變。進一步對伴發突變基因測序分析，表明CEBPA單突變更易伴發DNMT3A、IDH1、IDH2等DNA甲基化修飾基因突變，也會伴發具有不良突變意義的基因DNMT3A、FLT3-ITD、TP53的突變，這可能是CEBPA單突變與CEBPA雙突變對預后影響不一致的原因[11]。

5 總結

基因突變檢測對AML的預后評估具有重要意義。近年來，FLT3-ITD、DNMT3A、C-KIT、CEBPA、NPM1基因突變對AML預后評估的研究基本明確，IDH等基因突變對預后的影響還需進一步研究證實。同時越來越多的基因突變被發現影響AML預后，單基因檢測已經遠不能滿足臨床需求，通過二代測序技術的應用對新基因突變的發現以及將不同基因突變組合對預后進行分層，為AML個體化治療方案奠定基礎。

參考文獻

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