干細胞相關(guān)基因Nestin在胃神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達及臨床意義

葉郁紅， 葉建剛， 陳余朋， 王 密， 王鵬程， 張 聲

Nestin是第Ⅵ類中間絲蛋白，與細胞的自我更新能力相關(guān)，目前被認為是腫瘤干細胞標記[1]。已有研究表明，Nestin在多種惡性腫瘤組織中表達，如膠質(zhì)母細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌[2-4]，但Nestin在胃神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(gastric neuroendocrine neoplasm, GNEN)中的表達情況尚不清楚，研究Nestin的表達將有助于加深對GNEN腫瘤干細胞的認識。本研究通過免疫組織化學法檢測Nestin在GNEN組織中的表達水平，分析Nestin表達與臨床病理特點及患者生存時間的關(guān)系，以期為GNEN的診斷、治療及預后提供幫助。

1 對象與方法

1.1對象 回顧性分析福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科2004年7月-2014年12月91例GNEN患者的臨床病理資料，所有GNEN患者術(shù)前均未接受化療或放療，術(shù)后病理診斷明確，病歷資料完整。男性72例，女性19例；年齡中位數(shù)60歲(20～81歲)；賁門42例，胃底-體30例，胃竇19例。按照2010年WHO新標準進行分類[5]，神經(jīng)內(nèi)分泌瘤(neuroendocrine tumor，NET)1級20例，NET 2級4例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌(neuroendocrine carcinoma，NEC)67 例(小細胞癌32例，大細胞癌13例，混合型神經(jīng)內(nèi)分泌癌[2]22例)。根據(jù)2010年WHO胃腸胰GNEN TNM臨床分期，Ⅰ期28例，Ⅱ期5例，Ⅲ期37例，Ⅳ期21例。同時選擇遠離腫瘤(距離>2 cm)的正常胃黏膜組織進行對照研究。隨訪數(shù)據(jù)完整的80例，其中死亡30例，生存時間平均18.6月；存活50例，存活者自診斷日期到隨訪日期11～98月，平均43.3月。

1.2方法 制備好組織芯片，采用EliVision Plus檢測試劑盒進行免疫組織化學染色；一抗Nestin(克隆號10C2)及Ki-67(克隆號MIB1)均購自北京中杉金橋公司。Nestin采用pH 9.0 EDTA修復，1∶200室溫孵育1 h；Ki-67采用pH 6.0檸檬酸修復，1∶400室溫孵育1 h。每批實驗均同時設立陰性對照和空白對照。

1.3結(jié)果判讀標準 Nestin表現(xiàn)為細胞質(zhì)染色。血管內(nèi)皮細胞的染色可作為陽性內(nèi)對照。根據(jù)著色強度和著色細胞百分率判斷結(jié)果。染色強度：無著色為0分，染色比血管內(nèi)皮細胞弱為1分，染色強度與血管內(nèi)皮細胞相當為2分，染色比血管內(nèi)皮細胞強為3分；著色細胞所占比例：無著色為0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分；兩項相乘，1～3分為陰性，4～9分為陽性。Ki-67：細胞核表達黃色顆粒者為陽性細胞，陽性細胞數(shù)>20%定為陽性，21%～50%定為低表達，>50%定為高表達。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，不同臨床病理參數(shù)Nestin陽性率的比較均采用非參數(shù)檢驗；不同生存曲線的顯著性用Log-rank法進行分析，P<0.05為差別具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1Nestin在GNEN組織中的表達 91例GNEN中，27例(29.67%)胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌(gastric neuroendocrine carcinoma,GNEC)表達Nestin，而24例胃神經(jīng)內(nèi)分泌瘤(gastric neuroendocrine tumor,GNET)及周圍正常胃黏膜組織均不表達Nestin(圖1)。25例GNEC Ki-67高表達，42例GNEC Ki-67低表達。Nestin與Ki-67在GNEC中的表達無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

A：胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌；B：胃神經(jīng)內(nèi)分泌瘤；C：正常胃黏膜組織.圖1 Nestin在胃神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤及正常胃黏膜組織中的表達 (EliVision ×200)Fig 1 Immunohistochemical expression of Nestin in gastric neuroendocrine neoplasm and normal gastric mucosa(EliVision ×200)

2.2GNEC組織中Nestin表達與臨床病理特征的關(guān)系 GNEC不同的浸潤深度中，浸潤肌層及以上的Nestin陽性表達率明顯高于浸潤黏膜/黏膜下層者，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Ⅰ～Ⅱ期GNEC的Nestin陽性表達率明顯低于Ⅲ～Ⅳ期，兩者比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；脈管侵犯的Nestin陽性表達率明顯高于無脈管侵犯者，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；GNEC男性患者Nestin 陽性表達率明顯高于女性患者(P<0.05)。其他臨床病理參數(shù)與Nestin表達無相關(guān)性(表1)。

2.3Nestin表達與GNEC患者生存率的關(guān)系 62例GNEC患者有詳細的隨訪資料，平均隨訪時間為31月。以Nestin表達與否將GNEC患者分為2組，繪制Kaplan-Meier曲線，比較2組患者生存率的差別。Log-rank檢驗顯示，Nestin陽性表達組患者生存率低，陰性表達組生存率高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

圖2 胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌Nestin的表達與生存曲線Fig 2 Kaplan-Meier survival curves based on Nestin expression in GNEC

表1Nestin表達與胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者臨床病理特征的關(guān)系

Tab1Relationship between the expressions of Nestin and the clinicopathological data in GNEC

臨床病理特征nNestin-+性別△ 男522725 女15132年齡/歲 ≥61301911 <61372116部位 賁門402218 胃底-體17125 胃竇1064形態(tài)學分型 小細胞癌291910 非小細胞癌382117l腫瘤/cm ≥5352213 <5321814浸潤深度△ 浸潤黏膜/黏膜下層761 浸潤肌層及以上602733脈管侵犯△ 無25196 有422121TNM分期△ Ⅰ+Ⅱ981 Ⅲ+Ⅳ583028淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無1376 有543321肝轉(zhuǎn)移 無463016 有211011Ki-67 高表達(>50%)251510 低表達(21%～50%)422517

Nestin表達與性別、浸潤深度、脈管侵犯及TNM分期比較，△：P<0.05.

3 討 論

GNEN是一個譜系的異質(zhì)性腫瘤，包括NET(G1級和G2級)、NEC(G3級)和混合性腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌(mixed adenoneuroendocfine carcinoma，MANEC)(G3級)[5]。筆者分析的GNEN大部分為NEC(占73.63%)，賁門為好發(fā)部位(占46.15%)；梁晶等分析了75例GNEN，也以NEC居多(占53.3%)，賁門好發(fā)(占54.7%)[6]，與筆者研究結(jié)果一致。此外，筆者通過在中國人群中分析不同級別GNEN中Nestin蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)部分GNEC標本表達Nestin，而GNET完全不表達Nestin，表明Nestin表達與GNEN組織學分級相關(guān)，Nestin的表達差別可能成為GNET與GNEC分型的輔助手段，也進一步證實了NET與NEC有著不同的發(fā)病機制[7]。

GNEC治療方式主要為手術(shù)及化療，其化療的有效率僅為31%[8]，因此如何避免化療耐藥成為改善患者預后的關(guān)鍵。目前的研究認為，腫瘤干細胞與放化療耐受能力密切相關(guān)[9]，而胃腸道神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織中已分離出具有強致瘤性的干細胞[10]，因此，如果能找到可靠的GNEC干細胞標志物，就能有效識別并靶向抑制腫瘤干細胞，從而提高治療有效率。巢蛋白Nestin是一種連接蛋白，參與細胞骨架的構(gòu)成，最初發(fā)現(xiàn)在星形細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤等神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中表達[2，11]，隨后發(fā)現(xiàn)也表達于一些實體癌，如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌[3，12-13]，并發(fā)現(xiàn)其表達與不良臨床病理特征相關(guān)。研究證實，Nestin為腫瘤干細胞標記物，它主要通過調(diào)節(jié)肌動蛋白和細胞黏附分子，從而影響腫瘤細胞的遷移、浸潤和轉(zhuǎn)移[14]。此外， Nestin在腫瘤細胞的增殖、凋亡中也起重要作用。Chen等的研究證實，沉默Nestin可能通過下調(diào)AKT-GSK3β-cyclin D通路而抑制非小細胞肺癌細胞增生[15]。

本研究顯示，Nestin在29.67%的GNEC中表達，而在正常胃黏膜組織中完全不表達，提示Nestin參與了GNEC的發(fā)病機制。其次，Nestin在多種腫瘤的研究中顯示其表達與不良臨床病理特征和不良預后相關(guān)。例如Nestin表達與胰腺癌的神經(jīng)侵犯及腹膜后組織侵犯正相關(guān)[13]；在膀胱尿路上皮癌中，Nestin表達與臨床分期相關(guān)，分期越晚Nestin表達越強，而且Nestin是提示預后差的獨立因子[16]。本研究中，Nestin陽性表達率隨TNM分期的進展而升高，Ⅲ～Ⅳ期與Ⅰ～Ⅱ期比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；浸潤肌層及以上組和浸潤黏膜/黏膜下層組陽性表達率分別為55%及14.29%，二者比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；脈管侵犯的Nestin陽性表達率明顯高于無脈管侵犯者，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在預后方面，Nestin陽性表達組患者的生存率顯著低于陰性表達組，這些研究結(jié)果與Nestin在其他腫瘤的研究結(jié)果一致，提示Nestin可作為輔助判斷GNEC臨床病理特征及預后的一種指標；Nestin表達越高，預示腫瘤組織中腫瘤干細胞的數(shù)量越多，腫瘤的侵襲性及耐藥能力就越高，從而預測腫瘤的生物學行為及患者的生存率，為GNEC的診斷、治療和預后判斷提供幫助。

通過臨床病理的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Nestin參與了GNEC的發(fā)生發(fā)展，而與GNET的發(fā)病機制無關(guān)；Nestin表達提示GNEC浸潤深、脈管侵犯幾率高、腫瘤分期晚以及患者的預后更差。而關(guān)于Nestin在GNEC腫瘤干細胞中的作用機制，目前還不清楚，有待于進一步的分子生物學研究。