循環(huán)腫瘤細胞的分離檢測技術(shù)及其研究進展

郭晗晗， 鄢樹楓(綜述)， 陳 卓(審校)

循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)自發(fā)現(xiàn)以來，因其在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要的角色已成為當前腫瘤學的研究熱點。作為一種“液體活檢”，通過隨時獲取CTC進行檢測，可用于指導臨床制定治療方案、判斷患者預后、評價療效等，在腫瘤患者的實時個體化醫(yī)療中具有獨特優(yōu)勢。但是,由于CTC在血液中的數(shù)量稀少，對比每毫升血液存在的500億個紅細胞和上億個白細胞而言，CTC的數(shù)目只能以個位數(shù)計，這對其檢測造成了極大的挑戰(zhàn)。因此，發(fā)展穩(wěn)定、靈敏及特異性高的檢測方法是開展CTC相關(guān)研究的關(guān)鍵。近年來，多種分離檢測CTC的設(shè)備取得了快速發(fā)展，為CTC的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。CTC的檢測主要基于其生物學特性(如標記蛋白的表達)或其物理特性(如大小、可變形性及電荷等)，筆者將針對目前CTC的分離檢測技術(shù)進行綜述。

1 基于CTC生物學特性的檢測方法

1.1基于CTC表面特異性蛋白質(zhì) 基于生物學特性檢測CTC的方法大多是通過識別CTC表面特異性表達的蛋白質(zhì)，最常用的方法之一是基于上皮特異性抗體表皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)進行檢測。如2004年強生子公司Veridex開發(fā)的Cell Search System是第一個也是唯一一個在美國、歐洲和中國均獲得臨床試驗批準的CTC檢測系統(tǒng)，基于CTC可同時表達EpCAM和細胞角蛋白(cytokeratins)8，18或19，但不表達白細胞標記蛋白CD45的特性[1]。Cell Search System利用結(jié)合了熒光染料的抗-EpCAM抗體磁性微粒，從血液樣本中分離出表達EpCAM的細胞，并利用結(jié)合了熒光染料的抗-CD45、抗-細胞角蛋白以及細胞核染料DAPI對CTC進行進一步篩選識別。Yoo等為進一步提高對CTC的檢測靈敏度，建立了SSDS方法，即將高密度的透明二氧化硅微珠表面與抗-EpCAM抗體結(jié)合，使CTC和微珠的復合體利用密度梯度離心與其他細胞有效分離[2]。該法對具有不同EpCAM表達水平的CTC具有良好的分離效果，尤其是對于低表達EpCAM的CTC細胞，比Cell Search System擁有更高的靈敏度。

大量研究表明，CTC具有高度異質(zhì)化現(xiàn)象。CTC在血液中可以不同形式存在，并具有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化功能(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)，即喪失上皮細胞特征，獲得類似干細胞的表型[3]。因此，僅基于EpCAM進行CTC檢測，可能丟失一些潛在的更重要的CTC亞型[4-5]。因此，除了EpCAM之外，選擇其他CTC檢測標記物，如表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)[6]，以及針對攜帶EMT的CTC細胞的靶向標記物角蛋白、波形蛋白等是十分必要的，否則易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，影響檢測準確度。

1.2基于CTC表面特異性標記物 近年來，除了利用天然抗體檢測CTC外，還出現(xiàn)了利用核酸適配子檢測CTC的方法[7-8]。與天然抗體相比，核酸適配子不僅與CTC表面具有更強的親和力和更高的特異性外，還有較高的穩(wěn)定性和良好的合成再現(xiàn)性，以及便于進行化學修飾等優(yōu)勢，尤其在不明確特定細胞標記物的情況下，可通過體外過程直接構(gòu)建細胞特異性核酸適配子[9]。

Zeng等建立了一種利用核酸適配子報告子檢測CTC的方法，該報告子是由適配子和一對具有熒光猝滅作用的熒光分子組成。當適配子靶向細胞表面特異性標記物時，觸發(fā)細胞內(nèi)化作用，發(fā)生溶酶體降解，導致具有熒光猝滅作用的一對熒光分子分離，從而發(fā)出熒光信號，達到檢測目的[9]。這個過程(一步法)在數(shù)分鐘內(nèi)就可以完成，克服了抗體介導的檢測方法實驗步驟多、耗費時間長等缺點。但單個適配子只能檢測單一狀態(tài)的CTC，限制了其在臨床上的應用。Zhao等利用已有的適配子組的協(xié)同作用，建立了隨機設(shè)計適配子混合物的方法，即通過硅納米線基板嵌入式微流芯片，加強在非小細胞肺癌中對CTC的微分捕獲(兩步法)[10]。以上這些基于核酸適配子檢測CTC的新方法，在理論上與傳統(tǒng)的抗原-抗體免疫結(jié)合的檢測方法相比，具有一定優(yōu)勢，但尚未得到臨床上的驗證。

1.3基于CTC基因表達 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription PCR，RT-PCR)技術(shù)的應用，使對一些極為微量RNA樣品的分析成為可能。基于CTC與血細胞基因表達的差異，可利用RT-PCR對CTC進行檢測。該方法的關(guān)鍵在于找到合適的標記基因，從而將其表達水平與樣品的腫瘤細胞數(shù)進行關(guān)聯(lián)。一般來說，PCR產(chǎn)物有兩種定量方法，即相對定量和絕對定量。絕對定量方法需建立目標基因的標準曲線，與實時定量PCR的記錄進行對比；而相對定量方法僅需將參考基因(基本上是持家基因，如GAPDH，18S，RPLP0或B2M)與目標基因同時擴增即可。基本步驟如下：首先對樣本預處理，如密度梯度離心等以富集CTC細胞；然后選擇目的基因進行RT-PCR，如MGB1，CK-19，EGFR Ⅷ，hMAM等[11]；最后對檢測結(jié)果進行分析，確定CTC的數(shù)量。

目前，不少實驗室建立了多通道RT-PCR檢測CTC的方法[12-13]。該方法只需極少量核酸就可同時檢測多個目的基因。其中，Adna Test方法是利用免疫磁珠進行分離后，再通過多通道RT-PCR檢測CTC，其檢測限可達到2個CTC。借助該項技術(shù)，對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者樣本的檢出率為69%；Liquid Bead Array方法則是將多通道RT-PCR結(jié)合液珠陣列檢測CTC，可同時檢測6個基因，既節(jié)省了時間，也減少了所需的樣品量。以上這些利用RT-PCR檢測CTC，因所需樣品量少、靈敏性高等優(yōu)點已受到廣泛關(guān)注。但也由于所需樣品量極少，附帶出所得結(jié)果的統(tǒng)計學價值以及可重復性等方面的缺憾。

2 基于CTC物理特性的檢測方法

由于CTC的異質(zhì)化特性，使其具有不同表型。因此，僅僅基于細胞表面特異性標記物來進行檢測會丟失某些其他表型的CTC[5,14]，使檢測的靈敏度受限。而基于CTC的物理特性對其進行分離檢測，可較大程度地獲得更多不同亞型的CTC。

2.1基于CTC直徑大小 某些CTC的直徑大于血液中正常紅細胞和白細胞，因此，利用聚碳酸酯微孔過濾器，即利用孔徑為8 μm的過濾器過濾分離CTC，可讓較小的紅細胞和血細胞通過而有效截留CTC。之后出現(xiàn)了具有精確工程性能的CTC微型過濾器，但由于過濾器上的孔隙是隨機產(chǎn)生的，孔隙之間排列不整齊，孔隙大小也不夠均一，分離效果不是很理想。后來，通過優(yōu)化微型過濾器，使其擁有精確的孔徑和排列整齊的孔隙，明顯提高了對CTC的分離效果[15]。使用離子束蝕刻聚碳酸酯膜也可形成具有均一過濾孔的材料，達到優(yōu)化基于CTC尺寸的分離方法，如基于細胞大小的上皮腫瘤細胞分離設(shè)備(isolation by size of epithelial tumor cells，ISET)[16]。據(jù)報道，以聚對二甲苯膜為材料建立的一種3D微型過濾設(shè)備，可以捕獲血液中CTC。此外，微流系統(tǒng)“屋脊式”結(jié)構(gòu)具有良好的分離與血細胞尺寸不同的CTC的效果[17]。如螺旋微流設(shè)備能在短時間內(nèi)處理大量樣本[18]，甚至在混合細胞的實驗中，也可達到至少85%的CTC檢測率。

2.2基于CTC可變形性 研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌和直腸癌CTC的尺寸與白細胞有重疊。與白細胞相比，這些CTC表現(xiàn)出更高的核質(zhì)比[19]。因此，可以基于細胞的可變形性來分離CTC和白細胞，進一步提高檢測的靈敏性。如微流分離平臺，這是基于細胞尺寸與變形性差異建立的平臺，可以對血液中CTC進行分離，獲得高純度CTC，還可進行后續(xù)的系列操作，如細胞培養(yǎng)、熒光原位雜交、組織病理學分析等[15]。Park等報道，借助震蕩流動使單個細胞通過錐形測微計時發(fā)生規(guī)模收縮而產(chǎn)生棘輪效應，可以讓CTC、白細胞及紅細胞產(chǎn)生不同的流動路徑，從而在尺寸基本相同的情況下達到無標簽分離血液中CTC的目的[20]。

2.3基于CTC表面粗糙黏附力 Chen等報道，由于腫瘤細胞和正常細胞對玻璃表面的黏附能力不同，可借助反應離子蝕刻(reactive ion etching，RIE)形成納米粗糙表面，成功捕獲不同類型腫瘤細胞[21]。

2.4基于CTC介電性質(zhì) 基于不同類型細胞間的電介質(zhì)差異，通過雙向介電電泳進行CTC分離，如DEP-FFF法可成功分離多種類型的腫瘤細胞。Moon等將多孔分流(multi-orifice flow fractionation,MOFF)與介電電泳結(jié)合用于乳腺癌CTC的分離，獲得了高分離效率[22]。Varadhachary等基于DEP-FFF分離方法，建立了商業(yè)化的微流平臺ApoStreamTM[23]。該方法的缺點在于：細胞質(zhì)和細胞膜的導電性在分離過程中會發(fā)生改變，因此需要弱化細胞間的相互作用來減小其影響。

3 集成設(shè)備檢測平臺

目前，對CTC的分離技術(shù)不僅要達到可靈敏地檢測CTC，而且要繼續(xù)對其藥物耐受性及轉(zhuǎn)移潛能進行分析。因此，結(jié)合多種CTC檢測分離方法，建立集成設(shè)備是目前針對CTC分離檢測的發(fā)展趨勢。Tang等將微流系統(tǒng)和免疫磁性分離系統(tǒng)結(jié)合，將CTC的捕獲效率提高到94%；同時，捕獲的CTC可在倒置熒光顯微鏡下進行原位觀察，有效減少了細胞損失，維持細胞活性高達93%[24]。此外，與免疫納米磁珠分離后的CTC還可繼續(xù)培養(yǎng)觀察。Zhao等利用硅納米基線板嵌入微流芯片，并結(jié)合適配子混合物對CTC進行分離[10]，這對表征CTC異質(zhì)化方面具有潛在的臨床應用價值。Adams等建立了多位一體的集成設(shè)備，可完成微型過濾器分離CTC、原位細胞培養(yǎng)、原位熒光雜交、組織病理學分析、H-E染色、光漂白以及復染等操作[15]。

4 結(jié)論與展望

筆者將近年來針對CTC的分離檢測方法進展進行了歸納總結(jié)(表1)。隨著CTC分離檢測手段的快速發(fā)展，越來越多的證據(jù)已表明，CTC作為液體活檢技術(shù)，在癌癥的早期檢測、轉(zhuǎn)移復發(fā)風險評估(預后信息)、治療靶標和耐藥機制的確定、實時治療的監(jiān)測、患者的分層等多方面均有重要應用價值。但是，目前CTC作為腫瘤標記物進入臨床檢測還有一定困難。CTC分離檢測技術(shù)進入臨床應用，亟待解決的問題之一是要建立統(tǒng)一、規(guī)范化的評價標準。此外，由于CTC在蛋白質(zhì)、RNA、基因組水平都攜帶了大量腫瘤部位的信息，CTC檢測手段已不僅僅局限于檢測，而是越來越側(cè)重于捕獲活的CTC細胞，通過其在細胞水平和分子水平上的表征，獲得包括相關(guān)腫瘤轉(zhuǎn)移與復發(fā)、藥物耐受性等信息。未來，這一領(lǐng)域仍將是研究熱點。

表1 循環(huán)腫瘤細胞分離檢測方法