Ac-SDKP調(diào)節(jié)Rac1信號(hào)抑制皮膚肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和遷移

王 姍， 張巧丹， 李世峰， 徐 洪， 楊 方， 楊 潔

研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)介導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞遷移和向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化是影響損傷修復(fù)和傷口愈合的重要因素，同時(shí)其異常活化也是介導(dǎo)瘢痕疙瘩形成的重要機(jī)制之一[1-2]。Rho GTP酶家族之一Ras相關(guān)的C3肉毒素底物(Ras related C3 botulin substrate 1, Rac1)能夠調(diào)控細(xì)胞遷移，也是參與Rho介導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和促進(jìn)瘢痕形成的關(guān)鍵調(diào)控因子之一[3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，N-乙酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP)能夠抑制TGF-β1活化和阻斷Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil-forming protien kinase，ROCK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而發(fā)揮拮抗肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和改善矽肺纖維化的作用[4]。本研究通過原代培養(yǎng)大鼠皮膚成纖維細(xì)胞，旨在觀察Ac-SDKP通過阻斷Rac1抑制皮膚成纖維細(xì)胞遷移和向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(fatal bovine serun，F(xiàn)BS)(德國PAA公司)；Ac-SDKP(瑞士Bachem AG公司)；TGF-β1、兔抗心肌蛋白相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(myocardin-related transcription factor, MRTF-A)(美國Sigma公司)；兔抗α-SMA、兔抗Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ, ColⅠ)及兔抗GAPDH(美國Abcom公司)；兔抗Rac1(美國Epitomics公司)；兔抗血清應(yīng)答因子(serum response factor, SRF)(中國Bilworld公司)。二步法通用型免疫組織化學(xué)試劑盒(PV6000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；二抗山羊抗兔IgG(美國KPL公司)；ECL顯色試劑盒(美國GE公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 出生1～2 d的乳鼠[中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,動(dòng)作合格證號(hào):SCXK(京)2010-0007]斷頸處死，消毒，剪開頸背部的皮膚并分離，PBS浸洗后剪成2 mm×10 mm細(xì)條，置于0.25%的Dispase酶中，4 ℃冰箱中消化過夜。次日PBS洗1次，眼科鑷分離皮膚組織的真皮和表皮，PBS浸洗1次，將真皮剪成1 mm3的組織塊。采用組織貼壁法，置于37 ℃培養(yǎng)箱，在含有10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。取第2代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；TGF-β1誘導(dǎo)組，無血清培養(yǎng)條件下，加入終濃度為100 nmol/L的TGF-β1誘導(dǎo)；Ac-SDKP預(yù)處理組，無血清培養(yǎng)條件下，先給予100 nmol/L的Ac-SDKP預(yù)處理1 h，再給予TGF-β1誘導(dǎo)。

1.2.2劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 將第2代細(xì)胞種植于6孔板，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時(shí)，用100 μL的無菌槍頭以6點(diǎn)的方向劃痕，PBS沖洗除去細(xì)胞碎片后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組刺激24 h后，倒置顯微鏡下觀測劃痕愈合。

1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測α-SMA及Rac1的表達(dá) 參照文獻(xiàn)[5]中的細(xì)胞爬片制備方法，固定，高壓修復(fù)，一抗(1∶150)4 ℃孵育過夜，37 ℃孵育二抗30 min，鏡下控制DAB顯色和復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封固。

1.2.4Western-blot法檢測α-SMA，SRF，MRTF-A，ColⅠ及Rac1蛋白的表達(dá) 提取總蛋白，BCA試劑盒測量蛋白濃度后，按照20 g蛋白/泳道上樣，常規(guī)電泳和電轉(zhuǎn)，5%牛血清白蛋白封閉，一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence, ECL)法顯色，伯樂凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行積分光密度(integral optical density, IOD)值定量分析，所得指標(biāo)與相應(yīng)內(nèi)參的比值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1Ac-SDKP對(duì)TGF-β1介導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞Rac1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)組的細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞核內(nèi)Rac1棕褐色陽性表達(dá)明顯，而Ac-SDKP預(yù)處理組可明顯抑制Rac1的陽性表達(dá)(圖1)。Western-blot檢測結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，TGF-β1誘導(dǎo)組的Rac1蛋白表達(dá)上調(diào)2倍，給予Ac-SDKP預(yù)處理后，Rac1表達(dá)下調(diào)至TGF-β1誘導(dǎo)組的18.75%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2，表1)。

2.2Ac-SDKP對(duì)TGF-β1介導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞遷移能力的調(diào)節(jié)作用 倒置顯微鏡下觀察顯示，與空白對(duì)照組比較，TGF-β1可以明顯促進(jìn)乳鼠成纖維細(xì)胞向劃痕空白區(qū)域遷移生長，給予Ac-SDKP預(yù)處理后再接受TGF-β1誘導(dǎo)，則可顯著降低細(xì)胞遷移，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

A：空白對(duì)照組；B：TGF-β1誘導(dǎo)組；C：Ac-SDKP預(yù)處理組.圖1 皮膚(肌)成纖維細(xì)胞Rac1的表達(dá)Fig 1 The expression of Rac1 in skin (myo)fibroblasts

C：空白對(duì)照組；T：TGF-β1誘導(dǎo)組；Ac：Ac-SDKP預(yù)處理組.圖2 皮膚(肌)成纖維細(xì)胞Rac1，α-SMA，SRF，MRTF-A及Col Ⅰ的定量表達(dá)Fig 2 The expression of Rac1，α-SMA，SRF，MRTF-A，Col Ⅰ in skin (myo)fibroblasts

分 組α-SMASRFColⅠMRTF-ARac1空白對(duì)照組0.70±0.101.08±0.240.98±0.330.82±0.270.97±0.05TGF-β1誘導(dǎo)組1.26±0.09☆1.83±0.03☆1.96±0.15☆1.44±0.48☆2.08±0.69☆A(yù)c-SDKP預(yù)處理組0.72±0.10☆#1.24±0.49☆#1.40±0.17☆#0.75±0.09☆#0.39±0.17☆#

TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1；α-SMA：α平滑肌肌動(dòng)蛋白；Col Ⅰ：Ⅰ型膠原. 與空白對(duì)照組比較，☆：P<0.05；與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，#：P<0.05.

A～C：倒置顯微鏡下觀察. A：空白對(duì)照組(C組)；B：TGF-β1誘導(dǎo)組(T組)；C：Ac-SDKP預(yù)處理組(Ac組); D:3組細(xì)胞遷移面積比較，與空白對(duì)照組比較，☆：P<0.05；與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，#：P<0.05.圖3 皮膚(肌)成纖維細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)Fig 3 Wound healing test of skin (myo)fibroblasts

2.3Ac-SDKP對(duì)TGF-β1介導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)作用 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)的α-SMA強(qiáng)陽性表達(dá)，呈纖絲狀平行交叉排列，給予Ac-SDKP干預(yù)后，α-SMA表達(dá)明顯減弱(圖4)。Western-blot檢測結(jié)果顯示，對(duì)照組的α-SMA，SRF，MRTF-A及ColⅠ表達(dá)水平均較低，給予TGF-β1刺激后，各蛋白的表達(dá)水平分別上調(diào)至對(duì)照組的1.8，1.69，1.76和2倍；而Ac-SDKP預(yù)處理組與TGF-β1誘導(dǎo)組比較，α-SMA，SRF，MRTF-A及ColⅠ分別下調(diào)至57%，68%，52%及71%(圖2，表1)。以上差別經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：空白對(duì)照組；B：TGF-β1誘導(dǎo)組；C：Ac-SDKP預(yù)處理組.圖4 皮膚(肌)成纖維細(xì)胞α-SMA的表達(dá)Fig 4 The expression of α-SMA in skin(myo)fibroblasts

3 討 論

瘢痕疙瘩是皮膚損傷愈合中，由于膠原合成代謝機(jī)能異常和持續(xù)亢進(jìn)，引起瘢痕組織過度生長的一種病理性過程。病理性瘢痕不但影響美觀，而且顯著影響患者的生理機(jī)能和生活質(zhì)量[1-2]。目前針對(duì)病理性瘢痕尚無較好的治療方案。對(duì)瘢痕疙瘩的治療一直是皮膚科和整形外科的難點(diǎn)之一。

研究表明，TGF-β1在介導(dǎo)正常損傷修復(fù)和病理性瘢痕的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。體內(nèi)外研究均顯示，TGF-β1能夠顯著促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞α-SMA和膠原蛋白表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)其遷移能力提高，導(dǎo)致瘢痕組織膠原沉積和病理性攣縮[6-8]。Rac1蛋白在正常的皮膚損傷愈合中，能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移和傷口收縮[9]。近來研究發(fā)現(xiàn)，Rac1在硬皮病患者的成纖維細(xì)胞中可調(diào)節(jié)N-甲酰肽受體介導(dǎo)活性氧生成[10]，針對(duì)Rac1的阻斷能夠抑制來源于硬皮病患者的成纖維細(xì)胞膠原的合成和肌成纖維細(xì)胞的分化[11]，提示Rac1在成纖維細(xì)胞中的高表達(dá)可能是其分泌膠原和促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞分化的重要機(jī)制之一。本研究也發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能夠顯著促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞Rac1蛋白表達(dá)，同時(shí)Ⅰ型膠原和肌成纖維細(xì)胞的相關(guān)指標(biāo)SRF，MRTF-A和α-SMA表達(dá)顯著上調(diào)，并伴有成纖維細(xì)胞遷移能力的提高，提示Rac1可能參與了對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞遷移能力和肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)控。

筆者所在課題組多年來圍繞Ac-SDKP抗纖維化作用進(jìn)行了系列研究，發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖、肌成纖維細(xì)胞分化和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制，是其抗器官纖維化作用的主要機(jī)制[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，Ac-SDKP能夠通過促進(jìn)血管生成、誘導(dǎo)上皮再生等機(jī)制促進(jìn)大鼠皮瓣移植的存活率[14]。國內(nèi)研究也顯示，Ac-SDKP能夠抑制人真皮成纖維細(xì)胞增殖，以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)，還能夠抑制成纖維細(xì)胞分泌TGF-β1[15-16]，提示Ac-SDKP具有潛在的抑制病理性瘢痕的作用。本研究結(jié)果顯示，Ac-SDKP能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化和遷移能力的提高，同時(shí)抑制了Rac1蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果將為系統(tǒng)研究Ac-SDKP的抗器官纖維化效應(yīng)機(jī)制，以及作為潛在的抗纖維化藥物提供進(jìn)一步的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而，本研究仍存在一些局限性，由于缺乏信號(hào)抑制劑，或是Rac1沉默或過表達(dá)的對(duì)照組，因此，很難明確判斷Ac-SDKP對(duì)Rac1起到何種調(diào)節(jié)作用。此外，目前僅從體外研究發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP對(duì)病理性瘢痕的潛在作用機(jī)制，但缺乏體內(nèi)研究的進(jìn)一步論證。這也將是課題組未來研究的重點(diǎn)方向之一。