銀屑病患者血漿中前蛋白轉化酶枯草溶菌素9的表達及對外周血CD4+T細胞活化的影響

胡煜 欒超 練霓 郝志敏 孫玉潔 王焱 顧恒 陳敏

中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病醫院江蘇省皮膚病與性病分子生物學重點實驗室，南京210042

研究發現銀屑病與許多系統性疾病密切相關，包括心血管疾病、肥胖、高脂血癥、糖尿病和代謝綜合征等［1-2］。前蛋白轉化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）是一種由肝臟合成的蛋白酶，能夠與肝臟低密度脂蛋白受體（LDLR）相結合，促進LDLR 降解，從而提高血漿低密度脂蛋白（LDL）濃度［3］。靶向抑制PCSK9 活性后能夠降低血漿LDL 濃度［4-5］。而且，PCSK9 可能是動脈粥樣硬化發病機制中的炎癥因子，可通過沉默PCSK9降低apoE敲除小鼠動脈粥樣硬化主動脈中腫瘤壞死因子α（TNF-α），Toll 樣受體4（TLR-4）和核因子κB（NF-κB）的表達［6］。此外，PCSK9還能夠通過誘導炎癥因子TNF-α、白細胞介素1（IL-1）和IL-6 來驅動巨噬細胞的炎癥反應［7］。為探究PCSK9在銀屑病發病機制中的作用，本研究檢測銀屑病患者外周血中PCSK9 的表達以及PCSK9 對外周血CD4+T細胞分泌細胞因子的影響。

對象與方法

一、對象

2016年2月至2017年12月于中國醫學科學院皮膚病醫院門診收集30例確診的尋常性銀屑病患者，其中男16 例，女14 例，年齡18 ～66（40.20±16.20）歲，病程1 個月至15（5.62 ± 4.42）年。所有患者均處于進展期，銀屑病皮損面積和嚴重程度指數（PASI）2.1 ～28.8（12.35±6.25）。所有納入患者近3個月內未系統使用糖皮質激素、維A酸制劑及免疫抑制劑等系統治療，1個月內未使用外用藥物或光療，無高血壓、糖尿病、高血脂、心血管疾病病史，無感染、腫瘤或其他嚴重系統疾病史，無自身免疫性疾病史，排除妊娠、哺乳期婦女。對照組30例為2016年2月至2017年12月于中國醫學科學院皮膚病醫院招募的健康志愿者，其中男15 例，女15例，年齡18 ～54（36.23±13.58）歲。患者組與對照組性別及年齡差異均無統計學意義（性別χ2=0.067，P=0.796，年齡t=-1.028，P=0.308）。本研究經過中國醫學科學院皮膚病醫院（研究所）醫學倫理委員會批準，批件號為（2016）快審第（KY019）號，所有研究對象均簽署知情同意書。

二、試劑

淋巴細胞分離液LymphoprepTM為挪威Axis-Shield 公司產品；Trizol 試劑為美國Invitrogen 公司產品；逆轉錄試劑盒HiScript Q RT SuperMix for qPCR、RT-PCR 試劑盒AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（High ROX Premixed）均來自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCSK9 Quantikine ELISA 試劑盒來自美國R&D Systems公司；BD IMagTMCD4+分離系統來自美國BD Biosciences 公司；人干擾素γ（IFN-γ）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒及人IL-17A ELISA 試劑盒來自美國RayBiotech 公司；重組PCSK9蛋白為美國BPS Biosciences公司產品。

三、方法

1.外周血單個核細胞（PBMC）分離和總RNA提取：取受試者靜脈血10 ml，1 000 r/min（離心半徑16 cm）離心10 min 分離血漿，用Ficoll 密度梯度離心法通過淋巴細胞分離液LymphoprepTM分離PBMC。Trizol 試劑提取PBMC 中總RNA，利用NanoDrop 2000C 超微量分光光度計測定在波長260、280和230 nm的吸光度，計算RNA濃度并評估純度。

2.實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測PBMC中PCSK9 表達：參照逆轉錄試劑盒HiScript Q RT SuperMix for qPCR說明書將總RNA反轉錄為cDNA。參照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（High ROX Premixed）試劑盒說明書進行qPCR反應，內參基因為3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。20 μl反應體系包括：10 μl AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，0.4 μl 正向引物，0.4 μl 反向引物，2 μl 模板cDNA 和7.2 μl 雙蒸水。反應條件為：95 ℃5 min 1 個循環；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 個循環；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s，1 個循環。PCSK9 正向引物5′-AGGGGAGGACATCATTGGTG-3′，反向引物5′-CAGGTTGGGGGTCAGTACC-3′。GAPDH 正向引物5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，反向引物5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′。

3.ELISA 法檢測血漿中PCSK9 表達：參照PCSK9 Quantikine ELISA 試劑盒說明書操作，繪制標準曲線，檢測血漿中PCSK9的表達水平。

4.外周血CD4+T淋巴細胞分離：分離PBMC加入10倍體積1×BD磁珠緩沖液洗滌，然后每107細胞加入50 μl BD IMagTMCD4+磁珠，混勻，室溫孵育30 min 后，加入1 ml 1×BD 磁珠緩沖液，將細胞轉移至FACS管中，置于磁力架8 ～10 min。之后棄上清液，將檢測管移出磁場，用1 ml 1×BD 磁珠緩沖液沖洗并重懸附于管壁的細胞后，重新置入磁場2 ～4 min，棄上清液，移出磁場，再次重懸后置入磁場2 ～4 min，棄上清液后所得細胞用于后續實驗。

5.CD4+T淋巴細胞的刺激培養：將分離的外周血CD4+T淋巴細胞以4×105個/ml的濃度接種于含5%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素及L-谷氨酰胺的RPMI 1640 培養液的24 孔培養板中。每例受試者的CD4+T 淋巴細胞均分為實驗組和對照組，實驗組加入2 μg/L 重組PCSK9 蛋白、對照組不加重組PCSK9蛋白培養24 h，收集培養基上清液。

6.ELISA法檢測培養基上清液細胞因子水平：參照人IFN-γ ELISA 試劑盒及人IL-17A ELISA 試劑盒說明書操作，繪制標準曲線，對培養基上清液中的IFN-γ和IL-17A水平進行定量檢測。

7.統計學分析：采用SPSS22.0統計軟件。計數資料采用χ2檢驗；計量資料用±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，血漿PCSK9濃度與PASI的關系采用Pearson相關性分析，P＜0.05判定為差異有統計學意義。

結果

一、銀屑病患者及對照組PBMC 和血漿中PCSK9的表達水平

qRT-PCR 均未檢測到銀屑病患者和對照組PBMC中PCSK9 mRNA的表達。

ELISA檢測顯示，銀屑病組血漿PCSK9水平為（243.58±11.91）μg/L，對照組為（199.74±31.09）μg/L，兩組差異有統計學意義（t=5.761，P＜0.001）。銀屑病患者血漿PCSK9水平與PASI評分無顯著相關性（r=0.187，P=0.431）。

二、PCSK9對銀屑病患者和健康對照CD4+T淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-17A的影響

銀屑病患者實驗組IFN-γ 和IL-17A 表達水平均高于銀屑病患者對照組（表1），兩組差異均有統計學意義（均P＜0.05）。健康對照實驗組和對照組均未檢測到IFN-γ和IL-17A的表達。

討論

PCSK9 是一種主要由肝細胞合成的分泌型蛋白，在機體中參與調控血脂和膽固醇代謝過程［8］。PCSK9 不僅能夠通過誘導LDLR 降解，提高血漿LDL 濃度，還可以通過與LDLR 之間的相互作用調節脂蛋白a的表達，從而參與調節膽固醇和脂類代謝［9］。此外，研究發現PCSK9在機體炎癥反應過程中也扮演著重要的角色。氧化的LDL 通過劑量依賴性方式影響巨噬細胞中IL-1α、IL-6 和TNF-α 的分泌，進一步上調PCSK9的表達［10］。Li等［11］研究發現，在穩定型冠心病患者中血漿PCSK9水平與白細胞計數呈正相關，提示血漿PCSK9表達與穩定型冠心病患者慢性炎癥狀態存在潛在的相互作用。同樣，研究表明，在類風濕關節炎（RA）患者中，血清PCSK9 水平明顯高于對照組，且與RA 病情活動度呈正相關，提示類風濕關節炎患者全身的炎癥狀態有可能誘導RA 患者PCSK9 表達增多，PCSK9 通過參與IL-1α、IL-6 和TNFα 等炎癥因子的分泌，參與并加重RA 的炎癥反應［12］。雖然已經明確PCSK9在代謝紊亂和免疫性疾病中起重要作用，但目前還沒有研究涉及PCSK9 與銀屑病發病機制的關系。本研究發現，銀屑病患者血漿PCSK9 含量明顯增高，提示PCSK9可能參與銀屑病的發病機制。

表1 ELISA法檢測PCSK9對銀屑病患者CD4+T淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-17A的影響（ng/L,±s）

表1 ELISA法檢測PCSK9對銀屑病患者CD4+T淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-17A的影響（ng/L,±s）

注：n=30。PCSK9：前蛋白轉化酶枯草溶菌素9；IFN-γ：干擾素γ；IL-17A：白細胞介素17A

組別實驗組（加PCSK9）對照組（未加PCSK9）t值P值IFN-γ 6 150.00±212.13 4 650.00±212.13 7.071＜0.05 IL-17A 1 532.00±11.31 698.5±266.58 4.418＜0.05

為了進一步研究PCSK9 是通過何種途徑參與銀屑病的異常炎癥免疫反應過程，我們分離培養了進展期銀屑病患者CD4+T 淋巴細胞，加入重組人PCSK9蛋白進行混合培養，發現PCSK9能夠誘導促炎癥細胞因子IFN-γ和IL-17A的分泌，而在健康對照人群CD4+T 淋巴細胞中未觀察到該變化，考慮可能與銀屑病患者異常的炎癥反應狀態相關。IFN-γ 作為Th1 細胞主要分泌的細胞因子，不僅在銀屑病患者血清中高表達，并且表達水平與銀屑病患者疾病嚴重程度相關［13］。IL-17A是Th17細胞的主要效應細胞因子，能夠刺激角質形成細胞產生趨化因子、細胞因子和其他促炎介質，從而維持銀屑病慢性炎癥狀態［14］。因此，我們推測PCSK9可能通過誘導CD4+T 細胞分泌炎癥細胞因子，從而促進銀屑病的異常炎癥免疫反應。我們研究發現，銀屑病組血漿中PCSK9表達水平高于對照組，但其表達水平與PASI 評分沒有相關性，推測PCSK9 可能作為CD4+T 細胞炎癥反應過程的誘導分子參與銀屑病的發生發展進程，但與銀屑病嚴重程度并不相關。

本研究仍有不足之處，首先未對CD4+T 淋巴細胞亞群進行分析。在銀屑病的發病機制中，除了Th1 和Th17 細胞亞群之外，以分泌IL-22 為主的Th22 細胞也在其中發揮重要作用。因此，應進一步探究PCSK9 與CD4+T 淋巴細胞亞群之間的關系。其次，角質形成細胞作為銀屑病另一重要靶細胞，其異常增殖、凋亡與銀屑病發病過程密切相關。接下來我們將研究PCSK9 對角質形成細胞表型的影響來進一步揭示PCSK9在銀屑病中的作用。

綜上所述，本研究顯示，PCSK9 在銀屑病患者血漿中明顯增高，PCSK9可能通過誘導銀屑病患者CD4+T 淋巴細胞分泌IFN-γ 和IL-17A 在銀屑病的發病機制中起重要作用。