不同底物間接免疫熒光對自身免疫性表皮下水皰病診斷的評價

于靈 馮素英 李志量 靳培英 王寶璽

1中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病醫院皮膚科江蘇省皮膚病與性病分子生物學重點實驗室，南京210042；2中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院皮膚科，北京100144于靈現在河南省人民醫院皮膚科，鄭州450003

由于自身免疫性表皮下水皰病患者體內存在抗基底膜帶中起真表皮連接作用的相關蛋白的抗體，導致基底膜帶結構破壞，發生真表皮分離。基底膜帶連接結構相對復雜，根據破壞結構及患者體內相應抗體的不同，自身免疫性表皮下水皰病存在較多類型，如大皰性類天皰瘡（bullous pemphigoid，BP）、瘢痕性類天皰瘡、獲得性大皰性表皮松解癥（epidermolysis bullosa acquisita，EBA）、大皰性系統性紅斑狼瘡、扁平苔蘚樣類天皰瘡、線狀IgA 大皰性皮病（linear IgA bullous dermatoses，LABD）、P200類天皰瘡等［1］，其對應臨床上表現也略有不同。診斷上，除組織病理可見表皮下水皰形成外，免疫病理對于明確診斷至關重要。直接免疫熒光法可見免疫球蛋白IgG、IgA和/或補體C3沿基底膜帶呈線狀沉積，但其陽性并不足以將各類自身免疫性表皮下水皰病區分開來；而間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）更為方便，且可多次進行，其中鹽裂皮膚IIF對于表皮下水皰病的診斷更為重要［2-3］。本文探討以正常人皮膚（normal human skin，NS）、猴食管（monkey esophagus，ME）及鹽裂皮膚（salt-split skin，SS）為底物行IIF，檢測自身免疫性表皮下水皰病循環抗體的沉積情況及其敏感性和特異性，為其在自身免疫性表皮下水皰病診斷中的應用提供參考。

資料與方法

一、臨床資料

收集2015年1月至2016年12月在中國醫學科學院皮膚病研究所就診的自身免疫性表皮下水皰病患者56 例。患者符合以下診斷標準：①臨床表現為皮膚或黏膜部位緊張性水皰；②皮膚組織病理表現為表皮下水皰病；③皮膚組織直接免疫熒光顯示免疫球蛋白IgG和/或IgA、補體C3沿基底膜帶呈線狀沉積。除符合上述標準外，BP患者還需BP180抗體檢測陽性；EBA患者還需行Ⅶ型膠原抗體檢測陽性；P200 類天皰瘡患者需通過免疫印跡檢測患者血清中存在與真皮側相對分子質量200 000蛋白結合的抗體，在200 000 處可見條帶；LABD 患者除符合①、②外，需直接免疫熒光顯示IgA 沿基底膜帶呈線狀沉積。納入的自身免疫性表皮下水皰病患者中BP 47 例，男29 例，女18 例，年齡21 ～94（67.4±16.9）歲；EBA 6例，男4例，女2例，年齡7 ～99（35.2 ± 35.7）歲；LABD 2 例，男性，分別2 歲、22 歲；P200 類天皰瘡為1 例56 歲男性。對照組為診斷明確的天皰瘡患者70 例，慢性濕疹15 例和健康成人15例，BP180抗體檢測均陰性。本研究通過中國醫學科學院皮膚病醫院醫學倫理委員會批準［（2014）快審第（KY004）號］，所有受試者均簽署知情同意書。

二、方法

1.血清采集：病例組患者及對照組均使用促凝管留取外周靜脈血5 ml，將所收集血樣標本離心后將血清分裝置于-80 ℃冰箱保存待檢。

2.試驗材料：正常人皮膚取自皮膚外科整形手術后殘留的正常皮膚，OCT 包埋后制成冰凍切片。鹽裂皮膚來自外科的正常人皮膚制備的鹽裂皮膚冰凍切片［4］。猴食管上皮IIF 檢測試劑盒［歐蒙醫學診斷（中國）有限公司］，異硫氰酸熒光素標記山羊抗人IgG 抗體（FITC-IgG，北京中杉金橋生物技術有限公司），BP180 抗體檢測試劑盒（日本MBL公司）。

圖1 不同底物間接免疫熒光陽性表達模式 1A、1B：大皰性類天皰瘡患者以正常人皮膚、猴食管為底物時熒光物質沿基底膜帶呈線性沉積；1C：大皰性類天皰瘡患者以鹽裂皮膚為底物IgG線性沉積于表皮側；1D：獲得性大皰性表皮松解癥患者以鹽裂皮膚為底物IgG線性沉積于真皮側

3.酶聯免疫吸附測定（ELISA）：按照BP180 抗體檢測試劑盒說明書操作，檢測BP 患者BP180 抗體滴度，酶標儀讀取吸光度后，按照說明書提供的公式計算血清抗體滴度值。

4.IIF：將制好的正常人皮膚、鹽裂皮膚冰凍切片用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3 次，晾干后滴加受試者血清（1∶10）于37 ℃孵育30 min，PBS 洗3 次，滴加FITC-IgG（1∶50）于37 ℃孵育30 min，PBS 洗3次，使用熒光顯微鏡觀察熒光表達情況。猴食管IIF按照試劑盒說明書操作。

5.熒光結果判讀：基底膜帶熒光物質呈線狀沉積為陽性。由2 名有經驗的研究者獨立判讀和分析，有爭議時由第三方有經驗的研究者獨立判讀及分析，決定最終結果。根據熒光結果計算IIF 檢測的敏感性與特異性，敏感性=真陽性人數/（真陽性人數+ 假陰性人數）×100%；特異性=真陰性人數/（真陰性人數+假陽性人數）×100%。

6.統計學方法：采用SPSS 13.0 軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗法。P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

一、不同底物IIF陽性表達模式

所有IIF 陽性患者均有熒光物質沿基底膜帶呈線性沉積。以鹽裂皮膚為底物BP患者44例可見熒光線性沉積于表皮側，EBA 和P200 類天皰瘡7 例均見線性沉積于真皮側（圖1）。另有2例尋常型天皰瘡患者在以正常人皮膚為底物、2例BP患者在以正常人皮膚和鹽裂皮膚為底物時表現為基底膜帶及棘細胞間熒光物質沉積。

對照組100例中有2例天皰瘡患者在以正常人皮膚和鹽裂皮膚為底物時出現熒光物質沿基底膜帶及棘細胞間沉積，1例慢性濕疹患者在以鹽裂皮膚為底物時出現熒光物質沿基底膜帶沉積，其余均為陰性。

二、不同底物IIF的敏感性與特異性

以正常人皮膚、猴食管、鹽裂皮膚為底物的IIF對表皮下水皰病診斷的敏感性分別為73.2%、60.7%、94.6%，對BP 診斷的敏感性分別為74.5%、63.8%、93.6%，差異均有統計學意義（P＜0.05），以鹽裂皮膚為底物時對表皮下水皰病、BP 診斷的敏感性高于以正常人皮膚、猴食管為底物（均P＜0.05）。見表1、2。

表1 以正常人皮膚、猴食管、鹽裂皮膚為底物間接免疫熒光檢測表皮下水皰病的敏感性（%）

表2 不同底物間接免疫熒光檢測大皰性類天皰瘡及表皮下水皰病的敏感性比較

以正常人皮膚、猴食管、鹽裂皮膚為底物的IIF對于表皮下水皰病診斷的特異性分別為98.0%、100%、97.1%，差異無統計學意義P＞0.05。

三、BP患者BP180抗體滴度比較

BP 患者BP180 ELISA 抗體滴度為94.1 ± 64.3（11.4 ～＞150）U/ml，以猴食管為底物時IIF陰性與陽性患者滴度分別為81.9 ± 49.5、101.1 ± 71.2，差異無統計學意義（t=-0.984，P＞0.05）。

討論

IIF作為一種重要的實驗室檢測方法應用于自身免疫性表皮下水皰病的診斷，其中鹽裂IIF 有著更為重要的意義，可用于自身免疫性表皮下水皰病的初步分類［4-5］。既往研究表明［6］，對于自身免疫性表皮下水皰病，鹽裂皮膚IIF 診斷敏感性較高。盡管新的檢測手段如酶聯免疫吸附試驗（ELISA）［7-9］等使診斷更加準確，但因IIF簡單、無創、易行，底物較易獲取，且價格低廉，適合臨床廣泛應用而仍有其存在的價值。

本研究對比了正常人皮膚、猴食管與鹽裂皮膚三種不同底物在自身免疫性表皮下水皰病診斷中的敏感性。以鹽裂皮膚為底物，IIF 敏感性優于正常人皮膚和猴食管，且差異均有統計學意義，因此，對于自身免疫性表皮下水皰病，鹽裂皮膚可替代正常人皮膚和猴食管為底物進行IIF，且其陽性率更高。Sárdy 等［10］曾評價以猴食管和鹽裂皮膚IIF 的敏感性及特異性，敏感性分別為73.2%、73.3%，特異性可達97.1%、100%，與本研究數據大致相符。而對于BP，鹽裂皮膚IIF敏感性同樣高于猴食管和正常人皮膚，且鹽裂皮膚與猴食管及正常人皮膚間差異均有統計學意義。本研究對照組中2 例天皰瘡及1 例濕疹患者同樣出現了基底膜帶熒光物質沉積，考慮存在假陽性可能，或因抗原表位擴展而導致基底膜帶熒光陽性。由于以正常人皮膚與鹽裂皮膚為底物時BP患者IIF陰性例數較少，以猴食管為底物時陰性例數相對較多，我們比較了以猴食管為底物時IIF 陽性與陰性患者BP180 滴度水平，兩者抗體滴度無顯著差異，說明IIF 陽性與否與BP180抗體滴度水平無關。

綜上所述，鹽裂皮膚IIF 為一種重要的自身免疫性表皮下水皰病診斷方法，其敏感性明顯優于正常人皮膚及猴食管為底物IIF，且可根據鹽裂皮膚IIF 熒光沉積情況對表皮下水皰病進一步分類診斷。其優點除了簡單易行外，鹽裂皮膚底物較猴食管更易獲得，且價格低廉。猴食管確已商業化，但價格昂貴，不適合臨床廣泛應用，且敏感性較鹽裂皮膚低，同時猴與人種屬不同，猴食管存在不能識別部分人源抗體的問題，因此鹽裂皮膚IIF 為更加理想的診斷方法。當然，與使用ELISA檢測循環抗體的方法相比，IIF仍存在一定的局限性，其判斷更為主觀，需要有經驗的臨床醫生進行判斷，且同樣存在假陽性及假陰性可能，因此有條件的情況下可聯合ELISA方法更加準確地診斷。