米非司酮對大鼠子宮內膜異位病灶中COX-2及VEGF表達的影響

南 燕，李玉潔

(新鄉醫學院第三附屬醫院婦產科，河南新鄉 453003)

子宮內膜異位癥是一種常見的良性婦科病癥，以慢性盆腔痛、性交痛、不孕、月經失調等為主要臨床表現，對生育期女性的健康造成嚴重不良影響，在不孕患者中發病率高達25%～50%[1]，但其作用機制尚未闡明，臨床治療難度較大，近些年來該病的發病率呈逐年上升的趨勢。目前臨床上治療子宮內膜異位癥的方法多種多樣，但是只有徹底明確藥物治療的作用機制，才能保障用藥安全性和合理性。本研究選取造模成功的子宮內膜異位癥大鼠作為研究對象，觀察不同劑量米非司酮對子宮內膜異位癥的療效，以及環氧合酶-2(COX-2)與血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取8周齡健康雌性SD大鼠,體質量200～220 g，由新鄉醫學院實驗動物中心提供，在室溫18～26 ℃、相對濕度40%～70%的環境內飼養，自由飲水、飲食。通過陰道脫落細胞檢查確認均為處于發情期的性成熟大鼠。

1.2方法

1.2.1造模及分組 用10%水合氯醛給予SD大鼠腹腔注射麻醉，在腹部正中做長約2 cm的縱行切口。分離大鼠子宮，切斷中部的一段子宮，兩端結扎。然后將管狀子宮剪切成兩塊子宮片段，大小均為5 mm×4 mm，其中一部分保存在-80 ℃冰箱凍存，另一部分縫合于腹部切口處腹肌與皮下筋膜層之間，常規關腹。術后每天觀察腹部切口及包塊情況，4周后再次開腹，可見移植病灶體積明顯增大，并有液體積聚的透明小泡，囊壁表面有新生血管形成，HE染色顯微鏡下觀察可見腺體及間質細胞，說明造模成功[2]。建模成功的112只大鼠分為對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組28只。

1.2.2藥物及劑量 采用米非司酮原藥粉，由浙江仙琚制藥公司提供。低、中、高劑量分別對應臨床用藥 10、12.5、25 mg/d，根據實驗動物學藥物換算公式：大鼠用藥劑量=(用藥劑量/60 kg)×大鼠體質量(kg)×6.25，進行計算后得出低劑量組給藥劑量為1.041 mg·kg-1·d-1，中劑量組給藥劑量為1.24 mg·kg-1·d-1，高劑量組給藥劑量為2.604 mg·kg-1·d-1。將米非司酮原藥粉與花生油進行融合，形成 1 mg/mL 混懸液后灌胃，對照組僅給予1 mL花生油灌胃。

1.2.3觀察指標

1.2.3.1異位內膜病灶體積變化 建模成功后用游標卡尺測量異位囊腫的長、寬、高，根據公式V=0.52×長×寬×高[3]，計算體積 V1。灌胃治療4周后，再次剖腹測量并計算異位囊腫的體積V2，處死大鼠取異位病灶組織，放入-80 ℃凍存。

1.2.3.2RT-PCR法檢測COX-2、VEGF的表達水平 Trizol裂解細胞，檢測并計算出RNA的濃度和純度，反轉錄后進行PCR，條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。COX-2上游引物:5′-AGA AGT TGA TAA TCG GGT AGT C-3′，下游引物:5′-CCT AGT GAA GGA TGG GTC-3′;VEGF上游引物:5′-ATC TTC AAG CCG TCC TGT GTG-3′，下游引物:5′-TTC TCC GCT CTG AAC AAG GC-3′;GAPDH上游引物:5′-GGC AAG TTC AAG GCA CAG-3′，下游引物:5′-GCC AGT AGA CTC CAC GAC AT-3′。采用2-ΔΔCt法計算出 COX-2、VEGF mRNA表達[4]。

2 結 果

2.1造模前后兩種內膜組織中COX-2、VEGF mRNA的表達情況 造模成功后大鼠腹壁異位內膜組織中COX-2 mRNA、VEGF mRNA的表達水平較造模前在位內膜組織明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 造模前后不同內膜組織中COX-2、VEGF mRNA表達比較

2.2各組大鼠異位內膜病灶體積變化 治療后，與對照組比較，其他3組異位內膜病灶體積明顯縮小，差異有統計學意義(P<0.05)；米非司酮各治療組治療后較治療前均有縮小，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠異位內膜病灶體積變化

a:P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與低劑量組比較；c:P<0.05，與中劑量組比較

表3 各組大鼠內膜異位組織中COX-2、VEGF mRNA表達

a:P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與低劑量組比較；c:P<0.05，與中劑量組比較

2.3各組大鼠COX-2、VEGF mRNA表達情況 不同劑量米非司酮治療組COX-2、VEGF mRNA表達水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，且隨劑量增加呈下降趨勢(P<0.05)，見表3、圖1。

圖1 各組異位內膜組織中COX-2、VEGF mRNA的表達

2.4Pearson相關性分析 COX-2 和VEGF 的表達具有明顯的相關性(r=0.782，P<0.05)。

3 討 論

子宮內膜異位癥是一種激素依賴性疾病，其發病機制目前尚不清楚，可能與年齡、月經周期、口服避孕藥等因素相關[5]，臨床表現主要有盆腔疼痛、月經紊亂及不孕等，且存在惡變的可能[6]。根據患者病情嚴重程度、年齡、有無生育要求及意愿等可選擇手術、藥物及手術聯合藥物治療等方法。目前臨床上常用的藥物有來曲唑、高效孕激素、促性腺激素釋放激素激動劑等[7]，但這些藥物均有明顯不良反應。

米非司酮可拮抗雌、孕激素，以及下調其受體，影響體內多種細胞因子的代謝和產生，如黏附分子、抗侵襲因子、抗血管生成因子等。自KETTLE等于1991年首次將米非司酮用于臨床治療子宮內膜異位癥，已有20多年，但其作用機制尚不明確，也無推薦的使用劑量?，F有的治方案中使用腹腔鏡與米非司酮聯合治療子宮內膜異位癥，臨床療效好，復發率降低[8]。有研究證實雌激素能促進COX-2表達，從而誘導PGE2 的產生，而米非司酮能通過其抗雌激素作用，干擾PGE2對異位子宮內膜的刺激作用[2]。也有研究表明，米非司酮能使宮內膜腺體及間質中雄激素受體(AR)表達增加,通過高雄激素抑制雌激素的作用。LI 等[9]通過大鼠異位癥模型證實米非司酮能夠降低COX-2基因轉錄,使其蛋白表達下降，從而達到降低前列腺素分泌。BOUCHARD研究表明：米非司酮可以抑制異位內膜病灶組織在腹腔中的植入及促進凋亡[10]。

COX-2是一種膜結構蛋白，能將花生四烯酸轉代謝成各種PG產物，多種生長因子、細胞因子、腫瘤啟動因子、激素等可誘導COX-2產生。研究表明,COX-2可能和子宮內膜異位癥的發生、發展相關,它參與了異位內膜血管的生成。COX-2對子宮內膜異位癥患者異位內膜高表達的機制如下：(1)雌激素可以直接或間接調節COX-2表達；(2)異位內膜損傷可產生如IL-1和IL-2等多種細胞因子，能刺激COX-2的表達；(3)子宮內膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，雌激素可以增加自身抗體合成，但后者能增加上皮細胞COX-2的表達。

血管形成是子宮內膜異位癥致病和病情進展的重要因素，VEGF可通過促進血管內皮細胞的增殖，促進血管形成和生長[11-12]，作用尤為顯著。黎俊伶[13]研究證實，VEGF參與了新生血管內皮細胞的有絲分裂，促進了新生血管的形成能力，與子宮內膜異位癥的發病、進展密切相關。秦江霞等[14]發現COX-2、VEGF、MVD在子宮內膜異位癥中的高表達，與在子宮內膜異位的血管生成有關。近期JANA等[15]發現MMP-2參與細胞遷移和侵入，可通過COX-2-PGE2-pAKT軸途徑促進子宮內膜異位癥的血管生成。SUTRISNO等[16]發現COX-2可以使腫瘤細胞內的VEGF表達上調，可能是通過一系列的轉導機制調控了VEGF的表達，參與了血管的生成。

本實驗結果顯示，造模前后在位子宮內膜組織和異位子宮內膜組織中COX-2、VEGF mRNA水平明顯升高。當給予米非司酮干預后，子宮內膜異位癥模型大鼠異位內膜病灶面積明顯縮小，說明米非司酮能有效抑制異位內膜的生長和侵襲，這與BOUCHARD研究結果一致。異位內膜組織中COX-2、VEGF mRNA水平明顯降低，說明COX-2、VEGF與子宮內膜異位癥的發生、發展密切相關，這些結果與秦江霞等的研究也相符。米非司酮對子宮內膜異位癥模型大鼠異位內膜病灶的療效具有劑量依賴性，米非司酮可通過下調COX-2的水平減少VEGF的生成，從而控制異位病灶蔓延，這也證實了SUTRISNO等的推理。本實驗證明較短周期的高劑量米非司酮對子宮內膜異位癥可取得較好臨床療效，而且米非司酮具有廉價、口服吸收快、生物利用度高、不良反應少等優勢，臨床應用價值高。但長期大量使用后伴隨的藥物副反應及藥物副反應最低的理想治療劑量的選取仍需進一步研究。本次實驗樣本量較小，后期仍需大樣本量資料驗證，期望為子宮內膜異位癥的臨床治療提供動物實驗參考。