拉西地平對自發性高血壓大鼠模型血管內皮的保護作用及機制分析

卞龍艷,武 玲,朱 慧

(1.江蘇醫藥職業學院,江蘇鹽城 224005;2.江蘇省鹽城市婦幼保健醫院護理部 224002)

高血壓作為一種常見的慢性病，是引發心腦血管疾病的主要因素，高血壓的發病原因較復雜，是由多因素、多基因共同作用的結果[1-3]。目前，關于高血壓的發病機制尚未明確，其相關研究仍是熱點，為了更好地探究其病理機制，動物模型成為一種必要的手段。SHR是一種自發性高血壓大鼠模型，其血管出現舒張功能減退和重塑，與人類接近[4]。血管內皮功能障礙是高血壓發病的重要因素，高血壓患者的血管內皮功能異常，進而引發其他臟器病變[5]。腸系膜動脈舒張度能夠反映血管的內皮功能狀態[6]。內皮素(endothelin，ET)作為一種強血管收縮劑，參與高血壓的發生、發展[7]。一氧化氮(nitric oxide，NO) 作為一種血管內皮舒張因子，能夠調節血管張力，維持血壓穩定[8]。間隙連接蛋白(connexin，Cx)是連接兩個相鄰細胞的主要組分，其能夠維持血管壁細胞之間的正常信息交流，保障血管的同步舒縮，從而發揮其正常功能[9]。血管炎癥反應參與高血壓的病理機制，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為一種炎癥因子，能夠促進平滑肌細胞增殖，造成血管收縮，血壓升高[10]。研究發現，拉西地平能夠選擇性的阻滯血管平滑肌的鈣通道，擴張血管，降低血壓[11]。此外，拉西地平還具有抗氧化性，能夠保護血管[12]。本研究采用自發性高血壓大鼠模型，探討拉西地平對其血管內皮的保護作用，并分析其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取20周齡的SPF級健康雄性Wistar大鼠50只為WKY組，20周齡的雄性自發性高血壓大鼠50只為SHR組，體質量(250±10)g，購自北京維通利華有限責任公司。 將50只WKY組大鼠分為兩組，分別為WKY對照組和WKY研究組，每組25只。將50只SHR組大鼠分為兩組，分別為SHR對照組和SHR研究組，每組25只。各組大鼠在種類、鼠齡和體質量方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1造模 所有大鼠均在清潔級環境中標準飼料，恒溫(21±2)℃，恒濕(55±5)%，人工光照每晝夜12 h，適應飼養1周后開始實驗。WKY研究組和SHR研究組大鼠給予拉西地平(西班牙葛蘭素威康集團，批準文號：注冊證號H20140294)0.72 mg/kg灌胃處理，WKY對照組和SHR對照組大鼠給予等體積的生理鹽水(氯化鈉注射液，杭州民生藥業有限公司，批準文號：國藥準字H33021575)，每天1次，持續8周。

1.2.2平均動脈壓 干預前、干預后采用無創血壓計BP-98A/B型在大鼠清醒狀態下檢測尾動脈收縮壓，測量3次，取平均值。

1.2.3腸系膜動脈舒張度 采用脫頸椎法將大鼠處死后，取其腸系膜動脈，置于Krebs Hensenleit(K-H)溶液中，并將其剪成3 mm左右的血管環。血管功能測定系統的37 ℃恒溫槽內持續充入5% CO2和95%O2的混合氣體，將血管環一端固定在槽底，另一端連接張力換能器。在K-H溶液中加入60 mmol/L KCl進行預收縮，待血管拉力達到峰值后，加入 0.1 mmol/L乙酰膽堿，比較各組大鼠腸系膜上動脈的舒張性，判斷血管內皮功能。

1.2.4主動脈Cx37蛋白表達水平 各組大鼠分別于干預后，采用脫頸椎法將大鼠處死取其主動脈，采用Western blot檢測主動脈Cx37蛋白表達水平。將動脈置于RIPA緩沖液中，在冰上充分研磨，離心取上清液，進行SDS-PAGE，然后將蛋白轉移至硝酸纖維膜，在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液清洗3次，ECL反應1 min，曝光，顯影，采用BCA法測定蛋白水平。

1.2.5血漿ET、血清NO及TNF-α水平 各組大鼠分別于干預后處死前采用腹主動脈取血法，每只大鼠分別采集3支試管的血液標本5 mL，1支試管加入抗凝劑混勻，4 ℃，3 500 r/min離心10 min，取上清；另2支試管，常溫靜置20 min后，以3 000 r/min離心5 min，取上清，均轉移至新試管待測，采用ELISA檢測ET、TNF-α水平，硝酸還原法檢測NO水平，試劑盒均購于美國IBL公司，嚴格按照說明書進行操作。

2 結 果

2.1各組大鼠平均動脈壓比較 干預前后，WKY研究組和WKY對照組大鼠平均動脈壓比較，差異無統計學意義(P>0.05)；SHR研究組和SHR對照組大鼠平均動脈壓明顯高于WKY研究組和WKY對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。與干預前比較，干預后的SHR研究組大鼠平均動脈壓明顯降低，且明顯低于SHR對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠平均動脈壓比較

2.2各組大鼠腸系膜上動脈舒張度比較 WKY研究組和WKY對照組大鼠腸系膜上動脈舒張度分別為(92.14±5.71)%、(91.34±5.67)%，差異無統計學意義(P>0.05)。與WKY研究組和WKY對照組相比較，SHR研究組和SHR對照組大鼠腸系膜上動脈舒張度(63.72±4.31)%、(36.48±6.53)%明顯降低(P<0.05)，而SHR研究組明顯高于SHR對照組(P<0.05)。

2.3各組大鼠主動脈Cx37蛋白表達水平比較 WKY研究組和WKY對照組大鼠主動脈Cx37蛋白表達水平0.98±0.09、1.02±0.08，差異無統計學意義(P>0.05)。與WKY研究組和WKY對照組相比較，SHR研究組和SHR對照組大鼠主動脈Cx37蛋白表達水平0.74±0.07、0.58±0.06明顯降低(P<0.05)，而SHR研究組明顯高于SHR對照組(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠主動脈Cx37蛋白表達水平

組別nET(pg/mL)NO(μmol/g)TNF-α(μmol/g)SHR研究組252.16±0.820.62±0.0592.05±18.24SHR對照組253.85±1.040.41±0.07152.42±34.87WKY研究組251.67±0.490.75±0.0643.42±19.73WKY對照組251.64±0.530.77±0.0445.32±21.06

2.4各組大鼠血漿ET、血清 NO及TNF-α水平比較 WKY研究組和WKY對照組大鼠血漿ET、血清 NO及TNF-α水平，差異無統計學意義(P>0.05)。與WKY研究組和WKY對照組比較，SHR研究組和SHR對照組大鼠血漿ET水平、血清 TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，而SHR研究組明顯低于SHR對照組(P<0.05)；SHR研究組和SHR對照組大鼠血清 NO水平明顯降低(P<0.05)，而SHR研究組明顯高于SHR對照組(P<0.05)，見表2。

3 討 論

高血壓是常見的慢性病，也是心腦血管疾病的主要危險因素。高血壓的發病機制和發病因素較復雜，血管內皮功能障礙是引發高血壓的主要因素。血管內皮是介于血液和血管壁之間的一道屏障，其能夠維持血管壁結構，參與免疫反應，介導炎性反應，調節血管平滑肌細胞生長[13]。研究報道SHR機體內普遍存在內皮功能障礙，血管舒張功能失衡引發血壓升高，而持續的血壓升高又導致血管內皮功能障礙，二者是相互促進的惡性循環[14]。由于高血壓患者均存在血管內皮功能損傷，改善患者的血管內皮功能是防治高血壓病情發展的重要環節。拉西地平一方面作為一種二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，能夠選擇性阻滯血管平滑肌的鈣通道，擴張血管，降低血壓；另一方面具有抗氧化性，能夠降低氧化應激反應對血管內皮的損傷作用，二者共同發揮保護血管的作用。

本研究結果顯示，與干預前相比較，干預后的SHR研究組大鼠平均動脈壓明顯降低，且低于SHR對照組(P<0.05)。說明拉西地平能夠有效降低自發性高血壓大鼠的平均動脈壓。由于拉西地平具有高度的血管選擇性，從而發揮強力降壓作用。

動脈舒張度反映血管的彈性功能，高血壓患者的動脈彈性隨著血壓的升高而減退[15]。造成這一現象的原因可能是高血壓引起脈壓增加，進而造成大動脈僵硬度增加，導致血管壁所受壓力增大，血管內皮受損，促進動脈粥樣硬化形成。本研究結果顯示，與WKY研究組和WKY對照組比較，SHR研究組和SHR對照組大鼠腸系膜上動脈舒張度明顯降低(P<0.05)，而SHR研究組明顯高于SHR對照組(P<0.05)。說明自發性高血壓大鼠的血管內皮功能受損，而采用拉西地平干預后，這種受損狀態得到改善。拉西地平的作用機制可能為通過調節血管活性物質，作用于鈣通道，擴張動脈，減低血管阻力，降低血壓，另外，其具有抗氧化性，能夠降低氧化應激反應，減少血管內皮的過氧化損傷，避免血壓升高和血管內皮功能障礙的惡性循環。

血管發揮正常的功能需要血管同步舒縮，而這依賴于血管壁細胞之間通訊系統的完整性。血管緊張度升高是引發心腦血管疾病的關鍵，表現為細胞間的電化學信息交流異常。文獻報道高血壓的發生、發展與間隙連接蛋白的異常有關[16]。本研究結果顯示，與WKY研究組和WKY對照組比較，SHR研究組和SHR對照組大鼠主動脈Cx37蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，而SHR研究組明顯高于SHR對照組(P<0.05)。說明自發性高血壓大鼠的血管壁細胞間縫隙連接的通訊異常，而采用拉西地平干預后，這種通訊狀態得到改善。推測高血壓可能降低Cx37蛋白表達水平，從而使細胞間縫隙連接的通訊異常，造成血管內皮功能紊亂，加重高血壓，而采用拉西地平干預后，由于其能夠降低血壓，改善血管內皮功能障礙，促進細胞間縫隙連接的正常通訊。

血管內皮通過分泌多種血管活性物質，例如血管舒張和收縮、氧化和抗氧化、炎癥和抗炎等因子，維持血管內環境和血管內皮功能的穩定。研究發現在高血壓病理狀態下，血壓持續升高會刺激血管內皮細胞，從而造成血管內皮功能障礙，引起ET水平升高，NO水平降低，導致血管收縮作用增強，舒張作用減弱，促進鈣離子內流，氧化應激反應增加，血管平滑肌細胞增殖，血壓進一步升高[17]。研究報道，在高血壓的發生、發展過程中，炎性反應起著重要作用，TNF-α、IL-6等因子的持續高水平表達可進一步加重血管內皮損傷。本研究結果顯示，與WKY研究組和WKY對照組比較，SHR研究組和SHR對照組大鼠血漿ET、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，而SHR研究組明顯低于SHR對照組(P<0.05)；SHR研究組和SHR對照組大鼠血清 NO水平明顯降低(P<0.05)，而SHR研究組明顯高于SHR對照組(P<0.05)。說明自發性高血壓大鼠的血管內皮損傷，而采用拉西地平干預后，血管內皮功能得到改善。推測高血壓可能造成內皮細胞受損，從而引起ET水平升高，NO水平降低，氧化應激反應增加，導致血管舒縮功能失衡，血管內皮功能障礙，血壓升高。采用拉西地平干預后，由于其能夠降低血壓，避免血管內皮功能損傷加重，此外還能夠促進細胞間縫隙連接的正常通訊，進而調節ET、NO等因子的表達水平，促進血管內皮功能恢復，同時其具有抗氧化性，能夠抑制炎性反應，減少生成氧化產物，改善血管內皮功能損傷。

綜上所述，拉西地平能夠有效降低自發性高血壓大鼠的平均動脈壓，保護血管內皮，其可能通過以下幾個方面：能夠選擇性阻滯血管平滑肌的鈣通道，擴張血管，降低血壓；能夠調節Cx37蛋白表達水平，促進細胞間縫隙連接通訊正常，進而調節血管舒張、收縮因子(NO、ET)的表達，維持正常血壓，避免內皮細胞功能損傷加重；具有抗氧化性，降低氧化應激反應，抑制炎癥反應，減輕血管內皮的損傷。