DAPK在人食管鱗癌組織及食管癌EC9706細胞中的表達及其對食管鱗癌轉移侵襲的影響

賈敬周,孫繼偉,袁五營,侯智亮,王文波,趙正國

(1.河南省胸科醫院微創外科,鄭州 450000；2.河南省鄭州市第七人民醫院普外科 450002)

食管鱗癌是我國居民消化系統最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率僅次于肝癌、胃癌、肺癌，以侵襲性強、致死性高為臨床特點，對居民健康造成嚴重危害[1]。雖然近年來食管癌的診治技術有了明顯提高，但依然存在生存率低、預后差等特點，因此深入研究食管鱗癌的具體轉移、遷移機制尤為重要[2]。

死亡相關蛋白激酶1(DAPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛參與機體多種病理生理過程，并在多種癌組織中異常表達，研究發現DAPK在非小細胞肺癌肺組織中的陽性表達率為34.7%，明顯低于癌旁正常肺組織的82.6%[3]。近年來不斷有研究發現DAPK在一系列癌細胞遷移中具有重要調節作用，可促進細胞凋亡，并已被證實在多種實體瘤及其細胞系中DAPK的表達缺失與腫瘤侵襲有關[4]，但未見DAPK在人食管鱗癌組織及食管癌EC9706細胞中表達的相關報道。因此，本研究通過人食管鱗癌組織樣本及人食管癌EC9706細胞檢測DAPK的表達，探討其與食管癌的關系，進一步研究DAPK過表達對食管鱗癌細胞轉移侵襲的作用，旨在為食管癌的臨床治療及預后提供新的思路和尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標本與細胞 人食管鱗癌組織及癌旁正常組織(距癌變組織3 cm以上并經組織病理學診斷無癌變)標本各20例，均為河南省胸科醫院微創外科及胸外科2016年5月至2017年6月的手術病理切除凍存標本，其組織學類型均為食管鱗癌。其中男12例，女8例，年齡45～72歲，平均(55.26±10.28)歲，患者術前均未行放療及化療。人食管癌細胞株EC9706細胞由中國醫科大學細胞生物研究中心提供。

1.1.2儀器與試劑 10%胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素、IMDM培養液均購自美國Gibco公司；Transwell小室購自美國Corning公司；鼠抗人DAPK單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體及兔抗小鼠二抗購自美國Sigma Aldrich公司；脂質體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，pReceiver-M29-DAPK質粒和pReceiver-M29質粒購自廣州復能生物技術有限公司；BCA蛋白分析試劑盒購自美國Pierce公司；RT-PCR試劑盒和逆轉錄試劑盒均購自日本Takara公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司；MK3型酶標儀和PCR儀購自美國Bio-Rad公司；HER Acell型CO2細胞培養箱購自美國Sim公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學法檢測人食管鱗癌組織及癌旁正常組織中DAPK的表達 所有組織標本均由病理科經10%福爾馬林固定，石蠟包埋后保存。每組隨機選取10個標本，每個標本取3張切片，按照免疫組織化學S-P法染色[5]，采用檸檬酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)高溫高壓抗原修復，常規透膜，5% BSA室溫封閉1 h，滴加DAPK鼠抗人多克隆抗體(1∶250)4 ℃過夜，生物素標記的二抗(1∶1 000) 37 ℃孵育1 h，DAB顯色，自來水沖洗終止，蘇木精復染后脫水、封片。每張切片隨機選取3個視野，用光學顯微鏡測定觀察區域陽性細胞數，并分級計算陽性率。陽性標準：細胞質或細胞核出現棕褐色顆粒。分級標準：陰性(-)，陽性細胞少于10%；弱陽性(+)，陽性細胞11%～50%；強陽性(++)，陽性細胞超過50%。陽性率=(弱陽性數+強陽性數)/總數×100%。

1.2.2細胞培養 將EC9706細胞復蘇后轉移至IMDM培養基中，置于37 ℃、5%CO2環境中培養并進行傳代，取2～3次傳代后的細胞用于實驗。將處于對數生長期的細胞轉移至6孔板中，密度為8×105個/孔，保證轉染時細胞密度為80%～90%。

1.2.3細胞轉染及轉染復合物的制備 將培養好的EC9706細胞接種于6孔板內，每孔1 500 μL細胞懸液；取250 μL Opti-MEMI無血清培養基用于稀釋4.0 μg pReceiver-M29-DAPK質粒(轉染組)；另取250 μL Opti-MEMI無血清培養基用于稀釋10 μL的LipofectamineTM2000；將以上兩種稀釋的液體混勻并于室溫放置20 min，取500 μL依次加入培養好的EC9706細胞內。置于37 ℃培養箱中繼續培養48 h后收集細胞用于后續實驗。空載脂質體pReceiver-M29(空白轉染組)轉染條件同轉染組，并以未轉染的EC9706細胞為對照組。

1.2.4Western blot檢測DAPK蛋白的表達 提取上述各組轉染前后的EC9706細胞總蛋白，變性后每孔50 μg進行SDS-PAGE電泳，然后電轉移至PVDF膜上，用含有5%脫脂牛奶的0.1%TBS-T室溫封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜，TBS-T洗膜10 min×5次，加HRP連接的兔抗鼠IgG 4 ℃振搖孵育1 h，TBS-T洗膜10 min×5次，用新鮮配制的DAB顯色液顯色，成像[6]。

1.2.5劃痕修復實驗檢測EC9706細胞遷移能力 取100 μL上述培養好的EC9706細胞接種于6孔板中，待各組細胞單層生長鋪滿板底時，用移液槍頭沿培養板底部劃“一”字型劃痕。各組EC9706細胞于37 ℃、飽和濕度及5% CO2環境下培養24 h。光學顯微鏡下觀察各組EC9706細胞向致傷區遷移的相對距離并拍照，隨后計算EC9706細胞遷移率[7]，細胞遷移率=轉染組細胞遷移面積/空白組細胞遷移面積×100%。

1.2.6Transwell小室侵襲實驗檢測EC9706細胞侵襲能力 Transwell 小室使用前鋪上10 μL的0.5% Matrigel 膜基質并于37 ℃孵育過夜。分別取200 μL上述培養好的EC9706細胞懸液接種于Transwell 小室上室，并在Transwell小室下室加入600 μL含有20%胎牛血清的RPMI 1640培養液。隨后各組EC9706細胞于37 ℃、飽和濕度及5% CO2環境下孵育培養24 h后取出Transwell小室，擦去上室內細胞，用0.1%結晶紫染色，轉用33%醋酸溶液洗脫，在Leica DC300F顯微鏡下隨機選取3個視野觀察并拍照，計算細胞計數[8]。同樣的步驟重復3次并取其均值。

2 結 果

2.1人食管鱗癌組織及癌旁組織中DAPK的表達 人食管鱗癌組織DAPK的陽性率為90.0%，明顯高于癌旁正常組織的13.3%(P<0.05)，見表1；在人食管鱗癌組織中DAPK的陽性區域面積明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，見圖1。

表1 DAPK在人食管鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達

2.2DAPK在EC9706細胞中的表達 蛋白印跡法(Western blot)顯示，在對照組和空白轉染組中未見明顯DAPK蛋白表達，DAPK蛋白在轉染pReceiver-M29-DAPK的EC9706細胞中高表達，見圖2。

2.3DAPK對EC9706細胞遷移能力的影響 與對照組細胞遷移率(36.42±8.52)%比較，轉染組細胞遷移率(83.26±8.42)%明顯升高(P<0.01)，空白轉染組細胞遷移率(43.45±11.56)%無明顯變化(P>0.05)，見圖3。

A:癌旁正常組織；B：食管鱗癌組織

圖1 DAPK在人食管鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(×400)

1:對照組；2：空白轉染組；3：轉染組

圖2轉染前后EC9706細胞DAPK蛋白的表達

A:對照組；B：空白轉染組；C：轉染組

圖3 DAPK對EC9706細胞劃痕修復的影響(×100)

2.4DAPK對EC9706細胞侵襲能力的影響 與對照組侵襲細胞數(50.2±4.3)個比較，轉染組侵襲細胞數(162.6±4.8)個明顯升高(P<0.01)，空白轉染組侵襲細胞數(46.45±7.5)個無明顯變化(P>0.05)，見圖4。

A:對照組；B：空白轉染組；C：轉染組

圖4 DAPK對EC9706細胞體外侵襲的影響(×100)

3 討 論

食管癌是世界上第八大常見癌癥，也是導致因癌癥死亡的第六大誘因，近年來估計每年有456 000例新發病例和400 000例死亡病例[9]。根據中國最新的癌癥統計數據，食管癌的病死率在男性中位居第三，女性中位居第五，呈逐年升高趨勢。食管癌可分為食管鱗癌和食管腺癌，它們是組織病理學、流行病學和分子學完全不同的兩種亞型[10]。食管鱗癌占全球食管癌病例的90%左右，而食管鱗癌患者的5年生存率盡管在過去10年有所改善，但仍然普遍較差。許多患者在診斷時表現出淋巴結轉移和腫瘤侵襲鄰近器官，缺乏有效的化療方法用于治療食管鱗癌患者[11]。因此，對食管癌致病機制需要進一步研究探討，以便為患者尋求更佳的治療手段。

DAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，廣泛參與調節多種細胞生命過程，如凋亡、自噬、細胞遷移等。DAPK在Ser308上磷酸化從而抑制了其在該位點的催化活性和去磷酸化，這也是DAPK被活化的重要標志。DAPK及其相關信號通路廣泛參與多種疾病，如癌癥、中風、炎癥和動脈粥樣硬化等[12]。

DAPK的功能在多種疾病中均受不同程度的影響。與p53等基因不同，DAPK在癌癥中的功能障礙通常是由于表達喪失而不是突變。DAPK表達缺失主要是由DAPK基因50UTR處的高甲基化引起的，盡管頻率不高也可能是純合缺失的結果[13]。在30多種癌癥中發現了DAPK基因甲基化，非小細胞肺癌的原發性組織和細胞系中DAPK蛋白仍然可以在高甲基化存在下表達。在其他如腎細胞癌和慢性淋巴細胞白血病中這種甲基化狀態也與蛋白質表達的錯誤相關，這表明DAPK的翻譯后調節在某些癌癥類型中尤為重要[14]。

1995年首次發現DAPK是干擾素-c(IFN-c)誘導人宮頸癌細胞凋亡的介質[15]。后來研究表明，DAPK-/-小鼠的胚胎成纖維細胞(MEF)由于p19ARF-p53途徑無法被激活而顯示出無法對癌基因如c-myc和E2F的過度表達的凋亡響應；同時在Lewis肺癌細胞中，高度分化轉移的細胞增加了DAPK的表達，并且在這些細胞減少了DAPK的表達后便抑制了它們在小鼠肺部轉移遷移的能力[16]。以上研究結果均表明DAPK對于抑制早期癌癥發展中的細胞轉化和晚期癌癥轉移是非常重要的。本研究證明，人食管鱗癌組織DAPK的陽性率及陽性區域面積明顯高于癌旁正常組織，同時在轉染后的EC9706細胞中同樣高表達，并且轉染后的EC9706細胞細胞遷移率及細胞侵襲數目明顯升高，這與上述文獻研究結果一致并表明在食管鱗癌組織中DAPK亦呈現高表達。

綜上所述，本實驗證實了人食管鱗癌組織中DAPK的高表達，DAPK能促進食管鱗癌細胞的轉移和侵襲。這表明DAPK同樣參與食管癌組織的病理生理過程，同時調節DAPK的異常表達將可能為食管癌的臨床治療及預后提供新的思路和尋找新的靶點。