利用內源元件在谷氨酸棒桿菌中分泌表達木聚糖酶

張偉，劉秀霞，楊艷坤，白仲虎

江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室 糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

木聚糖酶 (XynA) 是一種可將木聚糖催化成低聚木糖或木寡糖的一類酶的總稱，其切割部位為底物的β-1,4糖苷鍵，廣泛存在于細菌和真菌中，是一種重要的工業(yè)酶類，在飼料工業(yè)、造紙業(yè)和食品行業(yè)等具有較大的應用價值[1]。木聚糖酶的生產(chǎn)與應用已由Juturu等[1]和Paes等[2]作過相關綜述，并介紹了木聚糖酶的來源、結構和相關酶學性質等。

目前，最常用于外源蛋白表達的宿主為大腸桿菌Escherichia coli，表達量高以及便于遺傳操作等使其成為蛋白表達的明星菌株。由于該宿主缺乏有效的分泌元件以及雙層細胞膜，使其主要用于胞內表達外源蛋白。Chen等通過對普魯蘭酶分子的CBM41和X25區(qū)簡化，得到的精簡普魯蘭酶能在PelB信號肽引導之下分泌到周質空間，實現(xiàn)了普魯蘭酶在大腸桿菌中的分泌表達[3]。為了克服大腸桿菌作為表達宿主的缺點，如含有內毒素、易形成包涵體及雙層細胞膜不利于蛋白分泌，人們開發(fā)了利用革蘭氏陽性菌為宿主的較為安全的表達體系來代替，如枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum表達體系等。作為表達宿主，枯草芽孢桿菌具有易于培養(yǎng)、安全和可分泌表達等[4]優(yōu)點，但部分情況下在表達蛋白過程中的錯誤折疊導致表達出的蛋白無活性，而利用谷氨酸棒桿菌則能正確地折疊蛋白并且具有活性[5]。谷氨酸棒桿菌自首次被分離出后就廣泛用于氨基酸的生產(chǎn)，如谷氨酸、賴氨酸、絲氨酸和異亮氨酸等[6-8]。除作為氨基酸和有機酸的生產(chǎn)菌株外，谷氨酸棒桿菌還是一種很有潛力的外源蛋白表達宿主。相對于大腸桿菌表達體系，谷氨酸棒桿菌表達體系有如下優(yōu)勢：可溶性表達外源蛋白，不易形成包涵體；細胞為單層膜，外源蛋白易于分泌到胞外，不需要破碎，純化較胞內表達容易；不含內毒素，比較安全[9]。在用谷氨酸棒桿菌進行氨基酸生產(chǎn)過程中，積累了大量的有關該菌的大規(guī)模發(fā)酵技術和經(jīng)驗，可以利用這些技術和經(jīng)驗實現(xiàn)外源蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。隨著谷氨酸棒桿菌的基因組序列測定完畢[10]，對其進行改造和構建工程菌株更為容易。

目前，關于谷氨酸棒桿菌分泌表達外源蛋白的研究主要集中于載體元件的構建和宿主的改造等。載體元件的選擇和構建是進行外源蛋白表達的重要過程。啟動子是表達系統(tǒng)的關鍵元件之一，通過控制轉錄影響外源蛋白的表達。啟動子的來源可從宿主中進行篩選，包括原有啟動子的突變和人工合成突變等。宿主中篩選如趙子豪等以egfp為報告基因，通過Golden Gate法從谷氨酸棒桿菌轉錄組數(shù)據(jù)篩選到了與強啟動子Pgro接近的AH6和Ptuf啟動子[11-12]，來自谷氨酸棒桿菌中的Psod等也屬于較強的啟動子并用于ScFv等的表達[13]，Zou等在谷氨酸棒桿菌中過表達GlyA時發(fā)現(xiàn)用強啟動子Ptuf能降低5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量[14]，同添加過量絲氨酸結果相同；原有啟動子的突變如Zhang等通過構建啟動子突變庫，以綠色熒光蛋白為報告基因，篩選到了P69啟動子，是tac啟動子的1.9倍[15]；Liu等利用tac-M啟動子結合CgR-S0949信號肽在谷氨酸棒桿菌中成功分泌表達了來自茂源鏈霉菌Streptomyces mobaraenseCICC 11018的轉谷氨酰胺酶[16]；人工突變合成啟動子庫如Rytter等基于谷氨酸棒桿菌-10區(qū)的序列(gngnTA (c/t) aaTgg) 及大腸桿菌的-35區(qū)序列通過PCR突變法構建了適用于谷氨酸棒桿菌的組成型啟動子庫，并基于大腸桿菌的lac啟動子的-10區(qū)和-35區(qū)之間序列的突變，構建了誘導型的啟動子庫并用于β-半乳糖苷酶的誘導表達[17]；Yim等以gfp為報告基因，結合流式分選技術，通過隨機突變篩選了啟動子PH36，并用于ScFv的表達[18]。除啟動子外，核糖體結合位點 (Ribosome binding site，RBS) 序列通過核糖體與mRNA的結合效率而影響著目的基因的表達[19]，并且RBS序列的改變還會影響轉錄效率間接引起翻譯水平的變化；Shi等通過合適的啟動子和RBS序列組合使γ-氨基丁酸 (GABA) 在谷氨酸棒桿菌中的產(chǎn)量超過25 g/L[20]。若進行分泌表達，信號肽是必不可少的元件，信號肽通過引導蛋白跨膜從而分泌到胞外，形成分泌表達，有利于下游的分離純化，這也是相對于大腸桿菌胞內表達的優(yōu)勢所在。目前在谷氨酸棒桿菌中的信號肽主要有兩種途徑，分別為Sec依賴型和Tat依賴型，其中Sec依賴型信號肽轉運非折疊蛋白[13]，而Tat型信號肽轉運折疊蛋白[21]。蛋白如GFP僅能通過Tat型信號肽分泌到胞外，通過Sec途徑不能分泌或分泌出極少量的無活性的蛋白[5]；淀粉酶等既能通過Sec信號肽分泌，又能通過Tat型信號肽分泌[22-23]。在分泌表達外源蛋白時，需要根據(jù)蛋白特性選擇合適的信號肽。

目前在谷氨酸棒桿菌中所用的表達載體大都為單順反子形式，即啟動子-5′UTR-目的基因；本研究中我們通過構建雙順反子分泌表達載體用于外源蛋白的分泌表達。相對于單順反子載體而言多了第一順反子后續(xù)的38 bp堿基以利于核糖體沿著mRNA進行翻譯，在遇到第二個SD序列以后，核糖體重新起始第二個順反子即目的基因的翻譯。利用此雙順反子載體以及合適的信號肽，成功分泌表達了來自天藍色鏈霉菌Streptomyces coelicolorA3(2)的木聚糖酶蛋白并在5 L發(fā)酵罐上進行了擴大培養(yǎng)，并對其部分酶學性質進行初步研究。為谷氨酸棒桿菌分泌表達外源蛋白提供了一種可用的工具，為進一步發(fā)掘谷氨酸棒桿菌基因組中基因功能、利用谷氨酸棒桿菌內源元件進行外源蛋白的表達奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌E.coliDH5α用于載體的構建和擴增；谷氨酸棒桿菌C.glutamicumCGMCC1.15647用于目的基因的表達。質粒pxmj19和PUC-xynA由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Axygen公司；限制性內切酶XhoⅠ和EcoRⅠ及T4 DNA連接酶購自Thermo公司；Q5超保真聚合酶購自NEB公司；氯霉素購自生工生物工程(上海) 股份有限公司；Endo-Xylanase Assay Procedure購自Megazyme公司；HRP-conjugated anti-His購自Proteintech公司，顯色液購自Thermo公司；其余試劑為國產(chǎn)或進口分析純。

電轉化儀和凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司；高速冷凍離心機為Thermo公司；核酸和蛋白電泳儀，北京六一儀器廠。

1.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

大腸桿菌：37 ℃在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)；谷氨酸棒桿菌：30 ℃在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在需要氯霉素抗性篩選時，在大腸桿菌中終濃度為15 mg/L，在谷氨酸棒桿菌中為10 mg/L。

1.1.4 引物合成和基因合成

實驗中所用引物及分泌表達的載體AH6-PS2和AH6-0949由蘇州鴻訊生物科技有限公司構建合成。上述兩個載體以pxmj19載體為基礎，帶有除木聚糖酶 (XynA) 以外的序列，包括AH6啟動子[11]、5′ UTR及其前38 bp的序列 (Gene ID：NCgl1316)、SD2 (AAAGGAGGACAAC) 和信號肽。其余載體為實驗室保存，載體結構如圖1所示。

1.2 方法

1.2.1 分泌表達載體的構建

AH6-09X和AH6-PSX的構建：以xynAF (5′-C CGCTCGAGGCCGAGAGCACGCTCGGCG-3′) 和xynA (5′-CCGGAATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTG GTGGGTGCGGGTCCAGCGTTGGTTG-3′) 為 引物 (在C末端添加了6×His標簽便于后續(xù)純化)，以PUC-xynA質粒為模板擴增木聚糖酶基因xynA序列。反應體系為：5×緩沖液 10 μL、dNTPs(各10 mmol/L) 1 μL、上下游引物各2 μL、Q5 DNA聚合酶0.5 μL、模板1 μL，補足ddH2O至50 μL。擴增條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 3 min。PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ酶切，用T4 DNA連接酶分別連接到同樣經(jīng)過XhoⅠ和EcoRⅠ酶切之后的AH6-0949和AH6-PS2載體上，分別得到AH6-09X和AH6-PSX，結構如圖1所示。

1.2.2 谷氨酸棒桿菌的轉化

上述的AH6-09X和AH6-PSX載體通過電轉化法轉入谷氨酸棒桿菌中[24]。

1.2.3 木聚糖酶在5 L發(fā)酵罐中的分泌表達

將含有AH6-PSX載體的谷氨酸棒桿菌在培養(yǎng)12 h后，取200 mL培養(yǎng)物接種到含有1.8 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L Applikon Ez-control發(fā)酵罐中。培養(yǎng)基成分為 (g/L)：葡萄糖 30，BHI 30，(NH4)2SO420，MgSO41，KH2PO41。發(fā)酵過程中，pH值控制在7.0，通過氨水及10%的磷酸調節(jié)pH；溫度控制在30 ℃，溶氧控制在30%。在12 h開始補料 (300 g/L的葡萄糖)，在取樣之后用循環(huán)泵迅速補料32 mL。每隔4 h取一次樣，測定其OD600和發(fā)酵液上清的木聚糖酶活性，用DNS法測定葡萄糖含量。

圖1 木聚糖酶分泌表達載體結構簡圖Fig.1 Brief architecture of vectors for XynA secretion.

1.2.4 分泌蛋白的檢測、純化及SDS-PAGE

木聚糖酶的檢測：按照Endo-Xylanase Assay Procedure試劑盒操作說明書進行。酶活定義：在試劑盒標準測定條件下，每分鐘催化底物釋放20 nmol的4-硝基酚所需酶量為一個酶活單位。

木聚糖酶的純化：使用AKTA Purifier System(GE Healthcare) 進行目的蛋白純化。帶有目的基因載體的谷氨酸棒桿菌在培養(yǎng)結束后，4 ℃、12 000×g離心5 min收集培養(yǎng)物上清。取25 mL經(jīng)0.22 μm濾膜過濾的樣品上樣到經(jīng)過A液(20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，pH 8.0) 平衡過的鎳柱上，然后用A液繼續(xù)平衡5個柱體積以洗下未與鎳柱結合的雜蛋白。平衡完畢后，用50%的B液 (20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑，pH 8.0) 洗脫，收集帶有蛋白峰洗脫液。

蛋白的純度分析通過SDS-PAGE進行，分離膠的濃度為12%，濃縮膠的濃度為4%。電泳電壓為100 V，結束后用考馬斯亮藍染液進行染色，脫色后置于凝膠成像儀拍照。Western blotting操作按照之前報道[25]進行，以 HRP-conjugated anti-His為抗體進行檢測。

1.2.5 最適pH及酸堿穩(wěn)定性

最適pH測定：分別在不同pH值的緩沖液配制木聚糖酶催化底物和稀釋酶液，測定木聚糖酶的活性。酸堿穩(wěn)定性測定：選用不同pH值的緩沖液稀釋酶液，于4 ℃冰箱存放24 h后測定木聚糖酶活性。以其中的最高酶活為100%，其余條件下測定的酶活以相對百分比與之相比較。pH的范圍為3.0–12.0，其中pH 3.0–6.0所用的緩沖液為100 mmol/L乙酸-乙酸鈉，pH 7.0–8.0為100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH 9.0–10.0為100 mmol/L的Gly-NaOH緩沖液，pH 11.0–12.0為Na2HPO4-NaOH緩沖液。

1.2.6 最適溫度及熱穩(wěn)定性

最適溫度測定：分別在20–80 ℃條件下測定木聚糖酶的活性，其余參數(shù)同標準條件。溫度穩(wěn)定性測定：分別將木聚糖酶在20–80 ℃條件下處理15 min，然后在40 ℃條件下測定木聚糖酶的活性。以酶活最高的一組定為100%，其余條件下測定的酶活以相對百分比與之相比較。

2 結果與分析

2.1 載體的構建

載體AH6-09X和AH6-PSX的主要結構如圖1所示，除一般載體所共有的復制起始位點、抗性基因等之外，上述兩個載體都是雙順反子形式的載體。含有AH6啟動子，AH6啟動子為本實驗室前期在谷氨酸棒桿菌中篩選到的表達EGFP效果較好的內源啟動子[11]，以AH6基因的前38 bp為第一順反子，第二個SD序列來自16S rRNA中出現(xiàn)較高頻率的序列[26]，信號肽基因cgR0949和cspB來自谷氨酸棒桿菌自身，分別為Tat和Sec依賴型，為谷氨酸棒桿菌的兩種主要的分泌途徑。構建雙順反子載體的原因是：雙順反子形式能通過第一順反子 (38 bp) 的翻譯使核糖體能夠結合到mRNA上，以及改變mRNA的二級結構更有利于翻譯進行，在核糖體遇到第二個SD序列之后，可以重新起始下一個順反子的翻譯，從而表達第二順反子即目的基因。在目的基因前加上信號肽能引導目的蛋白分泌到胞外，形成分泌表達。在大腸桿菌中，雙順反子結構表達較單順反子穩(wěn)定[27]，在谷氨酸棒桿菌中，雙順反子形式的表達往往優(yōu)于單順反子表達[11,19]。

2.2 木聚糖酶的表達及其分泌

將構建好的載體分別轉入谷氨酸棒桿菌中進行表達。胞內表達的木聚糖酶酶活通過超聲破碎后檢測，分泌表達的木聚糖酶酶活取發(fā)酵液上清進行檢測。檢測結果如圖2所示，在帶有AH6-PSX載體的谷氨酸棒桿菌發(fā)酵液上清中檢測到木聚糖酶活性為486.2 U/mL，說明木聚糖酶能夠由本載體中的啟動子和SD等原件啟動表達，并且在CspB信號肽的引導下能夠分泌到胞外，上清經(jīng)過鎳柱一步純化即可得到較為單一的條帶 (圖2)；在帶有AH6-09X載體的谷氨酸棒桿菌發(fā)酵液上清中檢測不到木聚糖酶活性，說明在此表達體系中，木聚糖酶不能通過CgR0949信號肽分泌到胞外。在胞內，木聚糖酶在AH6-09X中的表達量為69.8 U/mL，稍高于在AH6-PSX中的表達量48 U/mL，可能是由于木聚糖酶在AH6-PSX中能分泌到胞外，而在AH6-09X中不能分泌到胞外，在胞內積累，因此高于在AH6-PSX中含量。但由于表達量都低于在AH6-PSX中的分泌表達量，因此，分泌表達是較優(yōu)的選擇。

圖2 木聚糖酶在谷氨酸棒桿菌中的分泌表達Fig.2 Secretion of XynA in C.glutamicum.(A)SDS-PAGE gel (lanes 1–5) of XynA production.Lane M:protein molecular mass marker; lane 1: sample from wild type C.glutamicum; lane 2: sample from C.glutamicum harboring pxmj19; lane 3: sample from C.glutamicum harboring AH6-09X; lane 4: sample from C.glutamicum harboring AH6-PSX; lane 5: purified XynA.(B) Western blotting analysis (lanes 1–3) of XynA production.Lane 1:sample from C.glutamicum harboring AH6-09X; lane 2:sample from C.glutamicum harboring AH6-PSX; lane 3:purified XynA.

上述結果說明，木聚糖酶在谷氨酸棒桿菌中的分泌表達優(yōu)于胞內表達，并對信號肽具有選擇性，適合于通過Sec型的信號肽分泌而不適于通過Tat型的信號肽分泌。蛋白分泌到胞外可不經(jīng)過菌體破碎而直接純化，簡化了純化過程，在工業(yè)化生產(chǎn)上能有效節(jié)約成本。同時谷氨酸棒桿菌為食品級安全菌，結合分泌表達，使得谷氨酸棒桿菌成為極具潛力的外源蛋白表達宿主。

2.3 木聚糖酶在5 L發(fā)酵罐的分泌表達

為了進一步提高本表達體系中木聚糖酶分泌表達能力，我們在5 L發(fā)酵罐對重組菌進行了擴大培養(yǎng)實驗。結果如圖3所示，接種之后，葡萄糖濃度維持在20–30 g/L，菌體的濃度隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，在第8小時時木聚糖酶的分泌表達量即接近了搖瓶水平 (481.8 U/mL) ，第12 h時分泌量首次超過搖瓶水平 (702.8 U/mL)，到第36 h菌體濃度達到最大，而后開始下降。SDS-PAGE圖上也可以看到在接種后培養(yǎng)4 h后即出現(xiàn)分泌的木聚糖酶蛋白條帶，并且隨著培養(yǎng)時間延長而增大濃度。經(jīng)過酶活檢測，木聚糖酶的活性在第36 h即達到最大，為1 648.7 U/mL，分泌量是搖瓶水平的3.4倍。同時由圖3A可知，木聚糖酶的分泌和菌體的生長有一定的關系，木聚糖酶的分泌量緊隨菌體的總量，可通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化進一步利于菌體的生長及提高蛋白的分泌量。除此之外，強啟動子能夠提高目的基因的轉錄水平，目的基因密碼子優(yōu)化能夠使原有的稀有密碼子減少，對應氨基酸的tRNA相對增加，從而提高蛋白翻譯效率[13]；在分泌表達時，信號肽效率的提高和目的蛋白在跨膜轉運過程中障礙的減少如宿主細胞壁的改造能有效提高蛋白的轉運效率而提高蛋白分泌水平[28]。

2.4 木聚糖酶最適pH和酸堿穩(wěn)定性

最適pH：如圖4A所示，在pH 3–12之間測定木聚糖酶活性時，在pH 5–7之間相對酶活保持在90%以上；pH值小于4或大于9時，酶活發(fā)揮不足最高酶活的54%，說明該木聚糖酶在此pH條件下不利于催化底物降解。為進一步確定最適催化pH，在pH 5上下分別選擇pH 4.5和pH 5.5進行酶活測定。結果表明，在pH 4.5時的酶活為pH 5時的1.02倍，說明該木聚糖酶的最適催化pH在4.5左右。

圖3 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶過程圖Fig.3 Fed-batch cultivation of C.glutamicum (AH6-PSX) for XynA production in a 5 L fermentor.(A) Profiles of cell growth (●), glucose concentration (?) and activity of XynA (■).(B) SDS-PAGE of culture supernatant during cultivation.Lane M: protein molecular mass marker; lane 1–13: supernatant samples taken at 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 20 h, 24 h, 28 h, 32 h, 36 h,40 h, 44 h, 48 h, 52 h after inoculation.Arrow indicates XynA.

圖4 木聚糖酶的最適pH和酸堿穩(wěn)定性Fig.4 The optimal pH and pH stability of XynA.(A) Optimal pH.(B) pH stability.

酸堿穩(wěn)定性：如圖4B所示，pH穩(wěn)定性測試結果表明該酶在pH 3–11時較為穩(wěn)定，處理后殘余酶活能保持在84%以上，在此較寬的pH范圍內較為穩(wěn)定。在pH低于3或高于12，處理后殘余酶活降至30%以下，可能是因為過酸或是過堿都會對酶本身造成損害，從而導致酶活的降低。

2.5 木聚糖酶最適溫度和熱穩(wěn)定性

最適溫度：如圖5A所示，在20–80 ℃測該木聚糖酶的最適催化溫度時，催化效率最高為40 ℃；酶活在30–60 ℃都能發(fā)揮60%以上活力；低于20 ℃酶活效力低于40%，而高于70 ℃酶活效率低于20%，說明此溫度范圍內不適于發(fā)揮酶活。為進一步精確該酶最適催化溫度，在40 ℃上下分別選擇35 ℃和45 ℃進行酶活測定。結果表明，在45 ℃時木聚糖酶的催化活性是40 ℃時的1.07倍，說明該木聚糖酶的最適催化溫度在45 ℃左右。

圖5 木聚糖酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性Fig.5 The optimal temperature and thermostability of XynA.(A) Optimal temperature.(B) Thermostability.

熱穩(wěn)定性：如圖5B所示，熱穩(wěn)定性測試結果表明該木聚糖酶在50 ℃前處理后殘余酶活能保持在95%以上，在此溫度范圍內較為穩(wěn)定。超過60 ℃，處理后殘余酶活降低至20%及其以下，說明溫度對該木聚糖酶影響明顯。在20 ℃時木聚糖酶雖能保持穩(wěn)定，但由于溫度不適于催化，因此不能有效發(fā)揮酶活；而超過60 ℃時，酶活較低的原因除催化溫度不適外，高溫對酶本身有一定的損害，二者共同作用所致。

3 討論

谷氨酸棒桿菌作為氨基酸和有機酸的生產(chǎn)菌，是一種GRAS (Generally regarded as safe) 菌，同時也是一種有潛力的外源蛋白表達宿主。利用谷氨酸棒桿菌作為宿主進行外源蛋白表達所需的表達元件來源廣泛，本實驗所用的表達載體中的關鍵元件均來自谷氨酸棒桿菌自身。第一順反子的啟動子AH6來自谷氨酸棒桿菌轉錄組中篩選到轉錄效果較強的內源啟動子，結合合適的SD序列已經(jīng)成功用于EGFP的表達。為了進一步驗證該表達框能否用于其他外源蛋白的表達及能否結合信號肽進行分泌表達，我們用木聚糖酶作為測試蛋白，木聚糖酶在內源的AH6啟動子和SD序列等元件作用下在谷氨酸棒桿菌表達之后，在內源的Sec依賴型信號肽CspB的引導下，成功分泌到胞外，說明谷氨酸棒桿菌內源元件組合能夠用于木聚糖酶的分泌表達，并且分泌表達量高于胞內表達量。進一步驗證了木聚糖酶適合于通過Sec途徑進行分泌，和文獻報道利用Sec型信號肽PorB分泌木聚糖酶一致[29]。木聚糖酶的分泌表達量在5 L發(fā)酵罐水平是搖瓶培養(yǎng)的3.4倍，說明擴大培養(yǎng)能有效提高木聚糖酶的生產(chǎn)，因為在培養(yǎng)過程中有補料添加和通氧等利于菌體生長的因素，這有利于木聚糖酶分泌和積累。而木聚糖酶的積累隨著宿主生長變化而變化，可通過進一步的優(yōu)化培養(yǎng)條件提高菌體的生長狀況以進一步提高蛋白的分泌量。木聚糖酶種類多樣，有酸性和堿性之分，本實驗用的木聚糖酶屬于酸性，等電點 (pI) 為酸性，最適pH為4.5在酸性范圍內；在45 ℃時酶能發(fā)揮最大催化效率，并且在此溫度下穩(wěn)定性較好，有利于持續(xù)的酶活發(fā)揮。Liu等報道在法夫駒形氏酵母Komagataella phaffii中表達的來自黑曲霉Aspergillus niger的木聚糖酶產(chǎn)量為1 827.19 U/mL，該木聚糖酶的最適溫度和最適pH分別為55 ℃和5.0[30]，和本實驗中的木聚糖酶有一定差異，可能是酶的來源及結構不同所致。不同木聚糖酶之間酶學性質差異較大，不同來源的木聚糖酶其分子量、pI、最適催化pH和最適催化溫度等已在Paes等綜述中作了介紹[2]。

本研究提供了一種利用谷氨酸棒桿菌的內源元件構建雙順反子表達載體，用于木聚糖酶的分泌表達，驗證了AH6啟動子能夠用于除EGFP之外的蛋白的表達，并且能夠在合適的信號肽引導下進行分泌表達。至于本表達體系能否用于其他蛋白的分泌表達，有待于進一步的研究；并且AH6啟動子并非是最強啟動子，若要進一步提高蛋白的表達量，可以通過更換較強的啟動子進行調節(jié)。此外，密碼子的優(yōu)化、合適的SD序列、強信號肽的選擇、宿主的改造如分泌過程中障礙的減少都能有助于蛋白的分泌。