穩定表達MVA途徑基因提高番茄紅素產量

李貞霞，陳倩倩,，唐金磊，李清艷，張學禮

1 河南科技學院 園藝園林學院，河南 新鄉 453000

2 中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308

3 中國科學院系統微生物工程重點實驗室，天津 300308

番茄紅素是類胡蘿卜素的一種，具有強抗氧化性和極強的清除自由基的能力[1]，對防治前列腺癌、肺癌、乳腺癌等有很好的療效，能有效抑制癌細胞擴散[2-4]。番茄紅素除了用于生產保健食品和藥品外，還能添加到冰淇淋、蛋糕等食品中，提高其營養價值，具有巨大的市場需求。微生物發酵生產天然番茄紅素不受光照、氣候、產地等條件的限制，且產品具有經濟、安全等優勢，因此該技術受到國內外市場的廣泛青睞。

番茄紅素等萜烯類化合物合成的前體物質異戊烯焦磷酸 (IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)，可以經甲羥戊酸途徑 (MVA途徑) 和2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑 (MEP途徑) 兩條途徑合成 (圖1)。近年來對重組大腸桿菌提高番茄紅素產量的改造主要集中在提高MEP途徑關鍵基因表達、引入外源MVA途徑基因提高前體物質供應方面。另外，近年來部分研究組通過代謝流分析等研究了非代謝途徑基因表達水平對萜類化合物產量的影響[5-9]。Alper等利用代謝流分析，驗證了敲除谷氨酸脫氫酶基因 (gdhA)、丙酮酸脫氫酶基因 (aceE)、轉醛醇酶基因 (talB)、甲酸脫氫酶基因 (fdhF) 對番茄紅素產量的影響，發現同時敲除gdhA、aceE和fdhF，產量提高37%[5]。Choi等發現高表達磷酸果糖激酶基因(pfkA)、6-磷酸葡萄糖異構酶基因 (pgi)、果糖-二磷酸醛縮酶Ⅱ基因 (fbaA)、磷酸甘油醛異構酶基因 (tpiA)、異檸檬酸脫氫酶基因 (icdA) 和蘋果酸脫氫酶基因 (mdh) 可以提高番茄紅素產量，fbaA、tpiA和mdh效果最明顯。gdhA和2,3-二磷酸甘油酸磷酸變位酶基因 (gpmAB) 雙敲除，同時高表達mdh和磷酸烯醇丙酮酸合成酶基因(pps)，番茄紅素產量達到283 mg/L[6]。Farmer等通過高表達pps，平衡磷酸烯醇丙酮酸PEP和3-磷酸甘油醛 (G3P) 供應提高番茄紅素產量[7]。Sun 等調控MEP途徑關鍵基因、中央代謝途徑和ATP合成途徑關鍵基因表達，進一步提高番茄紅素產量[8]。Wu等通過增加產番茄紅素大腸桿菌株細胞膜的含量，增加菌體承載番茄紅素的能力進一步提高番茄紅素產量[9]。

將MVA途徑基因引入大腸桿菌可以提高萜類化合物前體物質供應，提高番茄紅素產量[10-14]。含有來自鏈霉菌屬 (Streptomycessp.CL190) 的整個MVA途徑的重組大腸桿菌，番茄紅素產量是僅含有MEP途徑的重組大腸桿菌的2倍。但是，甲羥戊酸途徑酶的高水平表達可能抑制細胞生長[11]。Pitera等發現過表達乙酰輔酶A乙酰基轉移酶基因 (atoB)、羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶基因 (mvaS) 和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶1 (hmg1)，可以使MVA途徑中間體羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMGCoA) 積累，從而抑制了細胞生長[15]。當使用MVA途徑增加紫穗槐二烯產量時，由erg12編碼的甲羥戊酸激酶 (MK) 被鑒定為另一種限速酶[16]。因此，MVA途徑各基因平衡表達，減少MVA途徑有毒中間產物積累，成為提高番茄紅素產量的重要手段。

Ye 等用Ⅱ型限制性內切酶基礎上的模塊(Type Ⅱs restriction based combinatory modulation，TRCM) 構建MVA途徑5個基因的RBS文庫，根據菌株顏色，篩選到分別使β-胡蘿卜素產量提高86%和96%的質粒[17]。本研究從已經精細調控MEP途徑基因的產番茄紅素菌株LYC101出發，研究MVA途徑協調表達對番茄紅素產量的影響，并整合MVA途徑基因使其穩定表達，提高番茄紅素的產量和產率。

圖1 重組大腸桿菌中番茄紅素合成途徑(表示包含多步催化反應)Fig.1 Construction of lycopene synthetic pathway in E. coli through MVA and MEP pathway.represents multi-steps reaction.

1 材料與方法

1.1 試劑

氨芐青霉素、氯霉素和SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒，購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；質粒小量快速提取試劑盒購自美國Axygen公司；Trans 2K Plus DNA Marker、EasyTaqPCR SuperMix DNA聚合酶購自北京全式金生物工程公司；PrimeSTARTMHS DNA聚合酶和DNase Ⅰ (Recombinant DNase Ⅰ，RNase-free，Cat，No 2270 A) 購自寶生物工程 (大連) 有限公司；Gold ViewⅠ型核酸染色劑購自北京索萊寶科技有限公司；PhusionTM超保真DNA聚合酶購自NEB公司；番茄紅素標品購自美國Sigma公司(Cat.No.75051)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計，Shimadzu UV-2550 spectrophotometer (Shimadzu，Kyoto，Japan)；PCR擴增儀，Eppendorf Mastercycler gradient；全自動凝膠成像系統，AlphaImager HP；電轉儀MicroPulser；臺式高速離心機，Eppendorf 5415D；高速冷凍離心機，Thermo Sorvall Evolution RC；高效液相色譜，Agilent Technologies Series 1200。實時定量PCR儀，CFX connectTMReal-Time system (Bio-Rad，Hercules，USA)。

1.3 菌株與質粒

本研究所用菌株和質粒見表1。

1.4 方法

1.4.1 培養基及培養方法

LB培養基：1 L培養基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和5 g氯化鈉；氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素終濃度分別為100、34、50 μg/mL。LB固體培養基含1.5%的瓊脂。

表1 本研究所用的菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

LB+2%甘油培養基：1 L培養基包含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g氯化鈉和20 mL甘油。

1.4.2 番茄紅素產量測定方法

保存于-80 ℃的菌種在LB平板上劃線活化，挑取單菌落接種到15 mm×100 mm試管 (含4 mL LB培養基) 中，37 ℃、250 r/min培養24 h，1%的接種量轉接到100 mL三角瓶 (含10 mL LB+2%甘油培養基) 中，37 ℃、250 r/min培養24 h。收集菌體用于測定番茄紅素含量。每個待測樣品分別有3個平行樣，實驗結果取自3個平行的平均值。

測定番茄紅素產量時，先取500 μL待測菌液，于13 000 r/min離心5 min，無菌水清洗后，用1 mL丙酮懸浮沉淀，在55 ℃黑暗條件下萃取15 min，然后將樣品在14 000 r/min下離心10 min，含有番茄紅素的上清過濾后用于測定番茄紅素產量。用高效液相色譜測定番茄紅素的濃度[12]。檢測條件：VWD 檢測器，Symmetry C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇：乙腈∶二氯甲烷 (21 ∶ 2 1 ∶ 8 )，流速1.0 mL/min，時間20 min，柱溫30 ℃，檢測波長480 nm。每個待測樣品分別有3個平行樣，實驗結果取自3個平行的平均值。用購自Sigma公司的番茄紅素標準品構建HPLC標準曲線。單位細胞干重 (DCW)用1OD600=0.343 g干細胞來換算。

1.4.3 整合質粒構建

用Golden Gate方法構建質粒[17-18]，首先構建pPoxB-N20質粒，用于將外源基因通過cas9輔助方法插入到重組大腸桿菌的丙酮酸氧化酶基因 (poxB) 位點。以pACYC184-gRNA質粒為模板，以N20-B-F1/N20-B-R1 擴增質粒骨架、以poxB-N20-B-F2/N20-B-R2為引物擴增含poxB基因上的N20片段的骨架，用poxB-bsaI-F1/poxBbsaI-R1擴增待整合區域，將3個片段用Golden Gate方法進行連接，得到pPoxB-N20質粒，構建流程見圖2。其中poxB-N20-B-F2引物上含cas9識別的poxB基因的一段與GCC相鄰的20個堿基(CGCCGACACGTTAGTGCTACT)，通過PCR將這20個堿基連接到gRNA上，用于識別目標DNA，并對其進行切割。

然后構建用于重組的pPoxB-ALV23質粒。用poxB-bsaI-F2/poxB-bsaI-R2對pPoxB-N20質粒進行擴增，得到含同源重組的poxB同源臂和cas9識別位點的N20的片段。用MVA-bsaI-F/MVAbsaI-R擴增pALV23質粒，得到pALV23質粒上MVA途徑幾個基因及其啟動子序列，將兩片段用Golden Gate方法進行連接，得到pPoxB-ALV23，用于在LYC101中進行同源重組。構建菌株及所用質粒見表1。本研究所用引物序列見表2。

1.4.4 CRISPR-Cas9系統輔助基因整合

根據Zhao等文獻報道[19]，用CRISPR-Cas9系統輔助整合MVA途徑基因。在LYC101菌株中轉化pRed_Cas9和pPoxB-ALV23質粒，然后用阿拉伯糖誘導cas9表達，對染色體poxB的N20區域進行切割，pPoxB-ALV23提供poxB同源臂和MVA途徑基因及啟動子進行整合。整合后用mvaE-430-r/poxB-yz-up引物進行驗證，整合成功、測序正確菌株命名為LYC102。驗證引物見表2。

2 結果與分析

2.1 質粒表達MVA途徑基因對番茄紅素產量的影響

為了消除MVA途徑中間產物積累對細胞生長的影響，本研究室用TRCM方法，通過構建RBS文庫，將來源于糞腸球菌Enterococcus faecalisCGMCC No.1.2135的乙酰輔酶A乙酰轉移酶/HMG-CoA還原酶基因 (mvaE) 和mvaS基因，以及來源于肺炎鏈球菌StreptococcuspneumoniaeCGMCC No.1.8722的甲羥戊酸激酶基因 (mvaK1)、磷酸甲羥戊酸激酶基因 (mvaK2)和甲羥戊酸5-焦磷酸脫羧酶基因 (mvaD) 用不同RBS連接到同一質粒上，得到使MVA途徑協調

表達、從而β-胡蘿卜素產量提高的一系列質粒[17]，其中pALV23和pALV145使β-胡蘿卜素產量最高，為了研究MVA途徑基因在重組大腸桿菌中對番茄紅素產量的影響，本研究將這兩個質粒轉化到兩株產番茄紅素重組大腸桿菌LYC001和LYC101中進行研究。LYC001是在整合來自成團泛菌Pantoea agglomerans的crtEIB基因的基礎上，分別用M1-37和M1-46啟動子對MEP途徑的idi和dxs進行調控的菌株，而LYC101是在LYC001基礎上對中央代謝途徑基因和MEP途徑關鍵基因ispG和ispH進一步調控所得，LYC101的番茄紅素產量遠遠高于LYC001菌株[9,20]。用這兩株菌為出發菌株，研究兩個質粒分別對兩株菌番茄紅素產量的應用，考察質粒在高、低產菌株作用是否相同。

圖2 質粒構建流程圖Fig.2 Construction of plasmid.

表2 本研究所用的引物Table 2 Primers used in this work

結果如圖3所示，LYC101中MEP途徑協調表達，消除中間體HMBPP積累引起的細胞毒性，細胞生長略優于LYC001，細胞OD600比LYC001高16.5%，而番茄紅素產量是LYC001的3.75倍。將pALV23和pALV145轉化LYC001和LYC101菌株后，對細胞生長沒有太大影響 (圖3A)。將pALV23和pALV145轉化LYC001后，番茄紅素產量分別提高了1.98倍和2.9倍，分別為14.87 mg/g DCW和19.45 mg/g DCW，兩個質粒對番茄紅素產量提高與Ye文獻中對β-胡蘿卜素產量提高結果一致，pALV145質粒提高類胡蘿卜素產量效果優于pALV23質粒。將pALV23和pALV145轉化LYC101后，番茄紅素產量分別提高了83%和37%，分別為34.12 mg/g DCW和25.66 mg/g DCW。pALV23質粒提高番茄紅素產量效果優于pALV145質粒，因為LYC101番茄紅素產量高于LYC001，推測在類胡蘿卜素產量不同的不同菌株中，使類胡蘿卜素產量更高的MVA途徑各基因表達比例并不相同，所以在低產類胡蘿卜素菌株中，pALV145質粒優于pALV23，而在高產類胡蘿卜素的菌株中，結果相反，可能和代謝流和代謝中間體積累有關。

2.2 MVA途徑基因整合質粒構建

因為質粒表達基因時，往往因為質粒不穩定而使質粒大量丟失，從而影響工程菌目標產物的產量[21]，為了使MVA途徑基因穩定表達，本研究將MVA途徑基因整合到LYC101的poxB位點。

圖3 MVA質粒在產番茄紅素菌株中驗證Fig.3 Lycopene production and cell growth of strains with pALV23 and pALV145.(A) Cell growth.(B) Lycopene yield.

分別擴增出構建poxB-N20質粒的3個條帶，結果如圖4A所示，分別得到2.2 kb的骨架1和400 bp的骨架2，以及2.9 kb的poxB基因片段。將3個片段用Golden Gate方法連接后，取陽性克隆用P15A-YZ-Up/Pox-bsaI-R2引物進行菌落PCR，驗證構建成功質粒，結果如圖4B所示，PCR得到1.25 kb條帶，序列正確的質粒為poxB-N20。

PCR方法擴增pALV23質粒上MVA途徑幾個基因及其啟動子序列；用PCR方法擴增含poxB-N20質粒，得到含poxB同源臂和poxB基因中間一段gRNA識別序列的N20片段，將兩片段用Golden Gate方法進行連接。將陽性克隆用P15A-YZ-Up/ mvaE-430-r進行PCR驗證，結果如圖4C所示，約1.85 kb條帶為正確克隆，得到pPoxB- ALV23，用于整合MVA途徑基因。

2.3 CRISPR-Cas9系統輔助整合MVA途徑基因提高β-胡蘿卜素產量

CRISPR-Cas9系統是一種強大的基因組編輯工具，利用靶點特異性的RNA (Guide RNA，gRNA)將Cas9核酸酶帶到基因組上的具體靶點，從而對特定基因位點進行切割。本研究根據Zhao等文獻報道，用CRISPR-Cas9系統輔助技術整合基因[19]。在LYC101菌株中轉化pRed_Cas9和pPoxBALV23質粒，然后用阿拉伯糖誘導cas9表達，對染色體poxB的N20區域進行切割，pPoxB-ALV23提供poxB同源臂和MVA途徑基因及啟動子進行整合。將誘導整合后菌液稀釋涂含阿拉伯糖和氯霉素、硫酸卡那霉素平板，用mvaE-430-r/poxByz-up引物對生長出的菌落進行驗證，結果如圖4D所示，PCR驗證得到1.5 kb的條帶，說明整合成功。將PCR驗證正確菌株，用PCR擴增完整MVA基因片段送樣測序，測序完全正確菌株為MVA途徑整合到LYC101的poxB位點的菌株。因為質粒不穩定，將本菌株在不加抗生素的LB液體培養基中培養24 h，在LB平板上劃線得到單菌落；挑取單菌落分別在LB平板和LB+氯霉素平板上劃線，在LB平板上生長而在LB+氯霉素平板上不生長的菌落為質粒丟失成功菌株，命名為LYC102。

圖4 構建質粒驗證及重組驗證Fig.4 Certify the correct plasmid and stain after MVA genes integrated.(A) PCR of backbone 1, backbone 2 and poxB gene for pPoxB-N20.(B) PCR verification of pPoxB-N20.(C) PCR verification of pPoxB- ALV23.(D) PCR verification of the recombination.

2.4 MVA途徑添加對番茄紅素產量的影響

將整合成功菌株LYC102和出發菌株LYC101發酵，比較整合MVA途徑對番茄紅素產量的影響。

結果如圖5所示，將質粒pALV23的MVA途經基因整合后菌株LYC102細胞生長略有降低，OD600從15.02降低到12.6，降低了12%，細胞生長變慢可能和MVA途徑基因表達不夠協調有關，MVA途徑各基因表達不協調引起中間代謝物積累，產生細胞毒性，從而部分限制細胞生長[15]。LYC102的番茄紅素產量明顯提高，從單位細胞產量18.68 mg/g增加到40.93 mg/g，增加了1.19倍，比用質粒表達MVA途徑基因的菌提高了20%。LYC101菌株中MEP途徑和中央代謝途徑已經進行過精確調控，經MEP途徑有效合成了萜類化合物合成的直接前體物質IPP和DMAPP，番茄紅素產量達到18.68 mg/g DCW，添加MVA途徑后，增加了IPP和DMAPP的供應，番茄紅素產率達40.9 mg/g。進一步提高了番茄紅素的單位細胞產量。

圖5 MVA途徑基因整合后菌株番茄紅素產量及生長Fig.5 Lycopene production and cell growth after integrating MVA genes.

3 討論

本研究利用從RBS文庫中篩選到的、使MVA途徑協調表達、利于β-胡蘿卜素合成的質粒pALV23和pALV145研究其對重組大腸桿菌產番茄紅素的影響。結果表明，兩個質粒在高、低產番茄紅素的菌株中都可以有效提高番茄紅素產量，但是，在高低產菌株中，兩個質粒反應不同。在低產菌株LYC001中，pALV145質粒菌株番茄紅素產量高于pALV23質粒菌株；而在高產菌株LYC101中，pALV23質粒菌株番茄紅素產量高于pALV145質粒菌株。pALV23和pALV145是從DXS37-idi46菌株中篩選而來，和LYC001基因型比較相似[8,22]，所以pALV23和pALV145在LYC001中的表現和在DXS37-idi46一致，即pALV145使LYC001和DXS37-idi46產類胡蘿卜素的量高于pALV23。而在番茄紅素產量較高的菌株LYC101中，pALV23和pALV145質粒對類胡蘿卜素產量的影響與它們在DXS37-idi46影響相反，在DXS37-idi46中產量低的pALV23，反而在LYC101中得到較高的類胡蘿卜素產量。LYC101與DXS37-idi46相比，不僅MEP途徑和類胡蘿卜素合成途徑進行過精確調控，中央代謝途徑的關鍵基因也進行過調控，菌株環境發生了改變，所以兩個質粒在菌株中反應也會不同。另外，pALV23和pALV145中MVA途徑各基因RBS理論強度存在差別[17]，推測pALV23前兩個基因RBS強度較高，可能是pALV23質粒在高產菌中利于類胡蘿卜素產量提高的關鍵因素。

本研究中MVA途徑基因整合后與MVA基因質粒存在相比，番茄紅素產量提高20%，推測是質粒在LYC101中不穩定引起的。Ye等研究發現[21]，用質粒表達外源基因時，發酵24 h，90%以上菌株質粒丟失；因此，本研究中因為質粒不穩定性，MVA途徑基因在質粒上以多拷貝形式存在時反而比染色體整合、單拷貝形式存在時番茄紅素產量更低。

另外，目前在大腸桿菌進行無痕同源重組通常是用red重組酶輔助，sacB進行反篩[22-23]。該方法需要進行兩步同源重組，并且因為sacB基因不是一個完全致死基因，如果插入片段較大，整合很困難，在反篩時很難得到整合成功菌株。本研究用CRISPR-Cas9技術輔助將MVA途徑基因和啟動子一共6.7 kb條帶一次性整合到LYC101菌株的染色體上，因為6.7 kb整合片段和同源臂在質粒上，在誘導過程中持續提供待整合片段，大大提高了整合效率[19]。

本研究通過同源重組將平衡表達的MVA途經基因整合到LYC101中，得到遺傳穩定的菌株LYC102，番茄紅素產率達40.9 mg/g，是出發菌株LYC101產量的2.19倍，比用質粒表達MVA途徑基因的菌株提高了20%。在重組大腸桿菌中同時表達合成萜類化合物前體物質的MVA途徑和MEP途徑，可以有效提高番茄紅素產量；本研究構建了不含質粒的、遺傳穩定的高產番茄紅素菌株，為產業化合成番茄紅素提供基礎；同時構建平臺菌株，可以用于其他萜類化合物合成。